[发明专利]将大肠杆菌表达的融合蛋白转化为利拉鲁肽的制备方法及应用

权利要求书

1.一种将大肠杆菌表达的融合蛋白转化为利拉鲁肽的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)将具有融合基因的大肠杆菌工程菌株进行发酵，诱导，提取含有融合蛋白的包涵体或者融合蛋白；其中，融合基因具有形如A-B-C结构的基因序列，其中A为伴侣蛋白编码基因，B为连接肽编码基因，C为Arg34-GLP-1(7-37)片段编码基因；

(2)将步骤(1)中获得的融合蛋白或者含有融合蛋白的包涵体在变性溶液充分溶解变性，并加入一定量的有机溶剂、缚酸剂及脂肪酸活化物，得到反应体系，反应，使融合蛋白与脂肪酸活化物酰化连接；

(3)待步骤(2)反应完成后加入工具酶，得到酶切体系；酶切，得到利拉鲁肽。

2.根据权利要求1所述的将大肠杆菌表达的融合蛋白转化为利拉鲁肽的制备方法，其特征在于：

所述的伴侣蛋白为KSI、PagP或TrxA蛋白；

所述的连接肽为如X₁…X_nK所示的肽序列，X为D或者E，n表示氨基酸X的数目，为2至4的整数。

3.根据权利要求2所述的将大肠杆菌表达的融合蛋白转化为利拉鲁肽的制备方法，其特征在于：所述的连接肽为EEEEK、EDK或DDDDK。

4.根据权利要求1所述的将大肠杆菌表达的融合蛋白转化为利拉鲁肽的制备方法，其特征在于：

所述的有机溶剂的用量按其在反应体系中的浓度为体积百分比为5～50％计算；

所述的缚酸剂的加入量按能够使反应体系的pH值达到8.0～12.0计算；

步骤(2)中所述的脂肪酸活化物的用量按融合蛋白：脂肪酸活化物的摩尔比例为1：1～10计算。

5.根据权利要求1所述的将大肠杆菌表达的融合蛋白转化为利拉鲁肽的制备方法，其特征在于：

步骤(2)中所述的变性溶液为尿素、盐酸胍和SDS中的至少一种；

步骤(2)中所述的有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、N-甲基-2-吡咯烷酮、乙腈和二甲基亚砜中的一种或至少两种；

步骤(2)中所述的缚酸剂为三乙胺，N,N-二异丙基乙胺和吡啶中的一种或至少两种；

步骤(2)中所述的脂肪酸活化物选自N^α-十六酰基-Glu(ONSu)-OBu^t或N^α-十六酰基-Glu(ONSu)-OH；

步骤(3)中所述的工具酶为具有切割连接肽中赖氨酸残基功能的酶。

6.根据权利要求5所述的将大肠杆菌表达的融合蛋白转化为利拉鲁肽的制备方法，其特征在于：所述的工具酶为赖氨酰内切酶。

7.根据权利要求6所述的将大肠杆菌表达的融合蛋白转化为利拉鲁肽的制备方法，其特征在于：所述的赖氨酰特异性内切酶的加入按包涵体中融合蛋白总量计算，1g融合蛋白加入2.5～20IU赖氨酰特异性内切酶。

8.根据权利要求1所述的将大肠杆菌表达的融合蛋白转化为利拉鲁肽的制备方法，其特征在于：

步骤(2)中所述的反应的条件为搅拌状态下反应3小时；

步骤(3)中所述的酶切的条件为pH8.0～10.5酶切8h。

9.权利要求1～8任一项所述的将大肠杆菌表达的融合蛋白转化为利拉鲁肽的制备方法在工业化制备利拉鲁肽中的应用。