[发明专利]八目鳗口腔腺CystatinF、制备方法及应用

说明书

本发明公开一种八目鳗口腔腺CystatinF、制备方法及应用，八目鳗口腔腺Cystatin F（Lm‑Cystatin F）与已报道的蛇毒蛋白cystatin仅有不到29%的序列一致性，与其他物种的序列一致性也非常低（30%~40%），能够以剂量依赖性的方式显著抑制人脐静脉血管内皮细胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVECs）的增殖，能够抑制血管内皮细胞分化形成小管结构，即具有抗血管新生活性。本发明以优化的八目鳗口腔腺Cystatin F基因制备重组八目鳗口腔腺Cystatin F，表达周期短且表达率高，所得蛋白为可溶性蛋白，不需要酶切，一步层析，具有操作简单、得率高等优点。

技术领域

本发明涉及一种蛋白、制备方法及应用，尤其是一种具有抗血管新生活性的八目鳗口腔腺Cystatin F、制备方法及应用。

背景技术

近年研究指出血管新生与多种疾病的发生及发展进程密切相关，例如脉络膜新生血管病、慢性炎症、银屑病、视网膜病、类风湿性关节炎，骨髓增生异常综合症以及肿瘤等等。

半胱氨酸蛋白酶抑制剂为一类对半胱氨酸蛋白酶具有抑制作用的蛋白质。根据分子结构及功能的不同，半胱氨酸蛋白酶抑制剂可分为胞内型stefins、分泌型cystatin和激肽原家族蛋白（kininogens）。II型cystatin家族成员主要分布于体液或分泌腺中，含有两对高度保守的链内二硫键以及用于胞外定位的信号肽。目前研究发现，II型cystatin主要能够抑制组织蛋白酶B、H、L和S，以及天冬酰胺内肽酶等蛋白酶的活性、在蛋白质代谢、细胞生长分化、血管新生、肿瘤发生发展进程、免疫调节等方面发挥重要作用。

目前，制备cystatin的方法有以下几种，存在着不同问题：

1. 从组织中分离纯化，步骤繁琐，需要几步层析联合使用，易残留杂蛋白，得率低；

2. 采用毕氏酵母表达，表达步骤繁琐，周期长；

3. 采用原核表达，表达量相对较少且以包涵体形式存在，蛋白无活性，需要经过后期的变性及复性过程才能使蛋白具有生物学功能，操作步骤繁琐；还有部分研究亦是采用原核表达，其所选载体需含有较大分子量的促溶标签才能得到可溶性蛋白，增加了后续酶切标签的步骤，不仅操作复杂，而且也容易引起新的杂蛋白，降低蛋白的得率。

迄今为止，尚未有关于八目鳗口腔腺cystatin F的分子特征及生物学功能的研究报道。

发明内容

本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种具有抗血管新生活性的八目鳗口腔腺Cystatin F、制备方法及应用。

本发明的技术解决方案是：一种八目鳗口腔腺Cystatin F，其特征在于DNA序列及氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

上述八目鳗口腔腺Cystatin F的制备方法，其特征在于依次按照如下步骤进行：

a. 将DNA序列如SEQ ID NO:2所示的基因克隆至表达载体pCold I并构建pColdI-Lm-cystatin F原核表达重组质粒；

b. 将pCold I-Lm-cystatin F原核表达重组质粒及含有分子伴侣pTf16的重组质粒同时转化至大肠杆菌BL21表达菌中；

c. 将阳性转化子接种至5 mL含有终浓度为0.1 mg/mL氨苄及终浓度为0.02 mg/mL氯霉素的LB培养基中，于37℃、120 rpm过夜振荡培养；

d. 将菌液加入到体积为500 mL的LB培养基中，于37℃、180 rpm培养至菌体达到对数生长期，即OD₆₀₀值为0.4~0.6；