[发明专利]一种宫颈高级别病变及宫颈癌相关基因甲基化检测试剂盒及方法

权利要求书

1.一种宫颈高级别病变及宫颈癌相关基因甲基化检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中包含的试剂有PCR反应液、固定于PCR八联管中的引物、阳性对照品、阴性对照品以及用于提取样本DNA的细胞裂解液；其中，

所述PCR反应液由dNTPs、Taq酶、染料和溶剂组成；

所述阳性对照品为宫颈癌细胞DNA；

所述阴性对照品为PCR用水；

所述的固定于PCR八联管中的引物包括6对宫颈病变标志物引物以及两对质控标志物引物；

6对所述宫颈病变标志物引物分别为宫颈病变标志物DLX1、ITGA4、RXFP3、SOX17、ZNF671、ASTN1的引物；

两对所述质控标志物引物分别为重亚硫酸氢盐质控QC和样本甲基化状态质控QM。

2.根据权利要求1所述的宫颈高级别病变及宫颈癌相关基因甲基化检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中包含12条固定有所述引物的PCR八联管以及相应数量的八联管盖，其中的10条所述PCR八联管用于样本检测，另外的2条所述PCR八联管分别用于阳性质控检测和阴性质控检测；所述PCR反应液的体积为1.1mL，所述PCR用水的体积为2mL；所述宫颈癌细胞DNA的体积为90μL，所述细胞裂解液的体积为500μL。

3.一种采用如权利要求1所述的试剂盒的宫颈高级别病变及宫颈癌相关基因甲基化检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1）利用细胞裂解液从样本沉淀物中提取样本DNA；

步骤2）取出一定量的所述样本DNA，使用重亚硫酸氢盐试剂盒进行处理和纯化，得到Bis DNA；

步骤3）在固定有6对宫颈病变标志物DLX1、ITGA4、RXFP3、SOX17、ZNF671、ASTN1的引物以及质控QC、质控QM的PCR八联管中加入一定量的所述PCR反应液，配制成PCR反应体系，并随后加入等量的所述Bis DNA，并密封；

步骤4）利用荧光定量PCR仪，按照以下扩增程序，对加入所述Bis DNA的所述PCR反应体系进行PCR扩增：

阶段1：94℃预变性1分钟；

阶段2：94℃反应15秒，67℃反应30秒，循环42次；

阶段3：95℃反应15秒，60℃反应20秒，95℃反应30秒，30℃反应60秒；

其中，在阶段2的67℃反应30秒的保温期和阶段3的95℃反应30秒之前的升温期收集荧光信号，并得出分析扩增曲线和熔解曲线；

步骤5）设置适用于样本的分析阈值和开始、结束循环基线，通过检测嵌入性荧光染料和定义熔解曲线峰值，分析扩增曲线和熔解曲线，分别获得标志物DLX1、ITGA4、RXFP3、SOX17、ZNF671、ASTN1、QC、QM的Ct值和Tm值；

步骤6）分别给出各个标志物的Ct值和Tm值的阳性判定范围；并且给6个宫颈病变标志物DLX1、ITGA4、RXFP3、SOX17、ZNF671、ASTN1分别赋予相应的分值；

步骤7）利用给出的各个标志物的Ct值和Tm值的阳性判定范围，分别评价6个宫颈病变标志物DLX1、ITGA4、RXFP3、SOX17、ZNF671、ASTN1的Ct值和Tm值；若某个标志物的Ct值和Tm值在阳性判定范围内，则将该标志物定义为阳性，并且获得该标志物所赋予的相应分值；若某个标志物的Ct值和Tm值超出阳性判定范围，则将该标志物定义为阴性，并且获得的分值为零；

步骤8）计算6个宫颈病变标志物DLX1、ITGA4、RXFP3、SOX17、ZNF671、ASTN1的分值总和，若分值总和小于样本阳性判定值，则样本检测结果为阴性；若分值总和大于等于样本阳性判定值，则样本检测结果为阳性，提示有宫颈癌变转化风险高，需要进一步阴道镜检查并结合组织病理检测结果。

4.根据权利要求3所述的宫颈高级别病变及宫颈癌相关基因甲基化检测方法，其特征在于：步骤1）中，所述的提取样本DNA的具体方法为，首先高速涡旋混匀样本5±1秒，并立即转移1mL样本到1.5mL EP管中；然后10.000×g，离心5分钟，小心移除上清液；接着向样本沉淀物中加入40μL所述细胞裂解液，并高速涡旋混匀3±1秒；最后将样本沉淀物与所述细胞裂解液的混合物置于在恒温摇匀器块中，60℃，1000rpm孵育30分钟，得到样本DNA。

5.根据权利要求3所述的宫颈高级别病变及宫颈癌相关基因甲基化检测方法，其特征在于：所述样本为宫颈脱落细胞。