[发明专利]一种用于检测哈维弧菌多重毒力基因的引物组、试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了一种用于检测哈维弧菌多重毒力基因的引物组，所述引物组包括8个引物对，每个引物对包括上游引物和下游引物，各引物的核苷酸序列如表1所示。还公开了含有上述引物组的用于检测哈维弧菌毒力基因的多重PCR检测试剂盒。以及上述引物组及试剂盒在检测环境样本中哈维弧菌污染中的应用。本发明针对已知8种哈维弧菌的毒力基因设计特异性引物，通过单管反应，一次性快速高效的检测8种基因而得知待检样品中是否含有携带毒力基因、具有潜在致病能力的哈维弧菌，其检测覆盖面广，可大大提高哈维弧菌致病性评价的准确性。

技术领域

本发明属于哈维弧菌技术领域，具体涉及一种用于检测哈维弧菌多重毒力基因的引物组、试剂盒及其应用。

背景技术

哈维弧菌(V.harveyi)又称哈维氏弧菌，是一种革兰氏阴性细菌，兼性厌氧，呼吸和发酵代谢，具有发光特性。该菌广泛分布于海洋环境及海洋生物中，能引起海水鱼类及其它养殖动物发病，是世界上许多国家和地区养殖对虾和鱼类的致病菌，也是中国海产经济鱼类弧菌病的主要病原菌之一。近年来，中国南海主要养殖鱼类的弧菌病病原出现以溶藻弧菌为主逐渐演替为哈维弧菌为主的优势种群替代现象，给海水养殖业造成了巨大的经济损失。

弧菌病一旦暴发便很难控制，因此，在水产养殖产业中，我们采用预防为主的防治措施，需要对养殖水体进行长期的实时监测。常规的检测哈维弧菌的方法费时费力，要经过菌株的扩增、选择性培养、理化鉴定和血清学反应等一系列复杂的过程，操作十分繁琐，而且检出率不高，不利于及时准确诊断哈维弧菌病。为了弥补哈维弧菌常规检测方法的不足，有必要建立一种高效、快速、简便的检测技术。目前报道的弧菌检测方法主要有免疫荧光技术和酶联免疫吸附法，但是采用这些方法需要有昂贵的仪器设备，而且ELISA法还需要制备特异性抗血清，不易于普及应用。随着分子生物学技术的发展和哈维弧菌全基因组序列测定的完成，人们对哈维弧菌的毒力基因和致病机制有了更加深入细致的了解，为从分子水平上鉴定哈维弧菌和确定菌株的毒力提供了理论依据和技术支撑。

目前已经报道的用于检测、鉴定哈维弧菌方法有很多，大多是用PCR(聚合酶链式反应)技术，扩增哈维弧菌的一段保守基因或一种特征性毒力基因，如：根据哈维弧菌溶血素基因vhh、外膜蛋白OmpK基因以及丝氨酸蛋白酶Serine protease基因的基因序列的特异性，设计相关的特异性较高的引物序列，对其进行PCR检测。但是，在哈维弧菌的致病性检测方面，这些方法的缺陷在于：检测内容过于单一，不能全面反应菌株的潜在致病力。

现有研究认为与哈维弧菌致病力相关的主要毒力因子有溶血素Vhh；蛋白酶类，包括丝氨酸蛋白酶Serine protease，金属蛋白酶VhpA等；以及群感效应蛋白，如AphA，LuxR等。自然情况下，绝大多数哈维弧菌属于水产动物体内和体表的正常菌群，只有极少数带有特定毒力基因的菌株才具有致病性。然而，由于毒力基因种类的多样性、分布的差异性，不同的致病菌株往往携带不同种的毒力基因。因此，在做致病性评估时，如何更快速准确对哈维弧菌(V.harveyi)的致病性进行评估是亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于检测哈维弧菌多重毒力基因的引物组，该引物组对哈维弧菌的特异性好、灵敏度高，能用于检测哈维弧菌多重毒力基因。

本发明的目的还在于提供包含上述引物组的用于检测哈维弧菌毒力基因的多重PCR检测试剂盒。

本发明的最后一个目的在于提供上述引物组或试剂盒在检测环境样本中哈维弧菌污染中的应用。

本发明的第一个目的是通过如下技术方案实现的：一种用于检测哈维弧菌多重毒力基因的引物组，所述引物组包括8个引物对，每个引物对包括上游引物和下游引物，各引物的核苷酸序列如下表1所示：

表1各引物的核苷酸序列