[发明专利]质粒载体及其构建方法、应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及质粒载体及其构建方法、应用。

背景技术

颗粒溶素(granulysin，GNLY)是存在于人类细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicTlympocytes,CFLs)和自然杀伤细胞(NKCells)胞浆颗粒中的细胞毒性蛋白。目前认为颗粒溶素有9kDa和15kDa两种形式。两种不同的形式同样都有生物学功能。但是市面是多数的载体构建都是表达其中的一种形式，或者是9kDa的，或者是15kDa的颗粒溶素蛋白。我们构建的双表达质粒载体，可以同时表达两种形式。将其转染到细胞中以后，两种蛋白都可以表达，并且表达量相当。氨基酸序列分析表明其与NK溶素和阿米巴溶素(抗微生物蛋白)同源，为脂结合蛋白一皂素样蛋白(saposin-likeprotein,SAPLIP)家族的成员之一。GNLYmRNA主要在CTL和NK细胞活化后，3—5天增加，5—7天剧增，在机体免疫应答过程中。

颗粒溶素是一种溶细胞和促炎症分子，表达于活化的人类细胞毒T细胞(CTLs)和自然杀伤(NK)细胞。目前认为颗粒溶素有9kDa和15kDa两种形式，具有溶细胞性、溶肿瘤性、杀菌活性、趋化作用、促炎症等功能。但是颗粒溶素对正常人细胞的毒性很低，所以在对抗耐药性细菌方面具有广阔的应用前景。

目前认为颗粒溶素有9kDa和15kDa两种形式。9kDa颗粒溶素是15kDa颗粒溶素的前体。9kDa颗粒溶素通过钙依赖通道途径释放到效应细胞与靶细胞之间。该颗粒溶素与其他皂素样蛋白家族同源，通过与靶细胞表面结合引起离子流，从而对多种微生物和肿瘤起溶细胞作用。15kDa颗粒溶素是自然杀伤(NK)细胞和细胞毒性T细胞(CTLs)通过非颗粒溶细胞途径释放到细胞外.其浓度在T细胞活化后升高。关于15kDa颗粒溶素溶细胞性说法不一，研究认为15kDa颗粒溶素有类似于9kDa颗粒溶素的溶细胞潜能。

现在广泛报道的颗粒溶素的表达载体的构建，主要有以下几个特点：(1)表达其一种形式：9kDa或者15kDa的。(2)使用的载体根据转染的细胞不同，可以是质粒载体也可以是病毒载体。但是，迄今为止，还没有同时将两种形式的颗粒溶素同时放到一个表达载体上的。

现在常用的同时表达两种蛋白的方式，是分别将带有不同蛋白的质粒转染到同一个细胞中，让细胞表达两种蛋白。这种方式的缺点是(1)不能确定细胞是否同时表达两种载体。因为在转染的过程中，不可避免的有一种细胞表达只表达其中的一种蛋白；(2)同一个细胞中两种蛋白的表达量不一样，一个多一个少，对后续的实验的开展造成很大的麻烦。

于是，近年来，质粒的双表达载体慢慢兴起。比如美国invitrogen的pIRES载体就同时具有2个多克隆位点区，可以同时表达2个蛋白。这种质粒也存在一个问题就是：IRES序列后面的下游基因的表达不稳定。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种质粒载体及其构建方法、应用。本发明提供了双表达载体是以此质粒载体为基础，使用具有自我剪切功能的p2A序列代替到IRES(内部核糖体进入位点序列)。这样在转染后，质粒从CMV启动子区域开始形成的mRNA可以自我剪切成2个独立的mRNA序列，分别表达两种基因，并且保证了两种蛋白的表达量相当，方便后续的研究。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了具有自我剪切功能的2A元件在构建质粒载体中的应用。

在本发明的一些具体实施方案中，所述具有自我剪切功能的2A元件选自P2A、T2A或E2A。

在本发明的一些具体实施方案中，所述质粒载体含有两个多克隆位点的所述具有自我剪切功能的2A元件。

在本发明的一些具体实施方案中，所述质粒载体还包括目的基因，所述目的基因为编码9kDa颗粒溶素的基因和/或15kDa颗粒溶素的基因。

本发明还提供了一种质粒载体，包括含有两个多克隆位点的具有自我剪切功能的2A元件以及目的基因。

在本发明的一些具体实施方案中，所述具有自我剪切功能的2A元件选自P2A、T2A或E2A。

在本发明的一些具体实施方案中，所述目的基因为编码9kDa颗粒溶素的基因和/或15kDa颗粒溶素的基因。

本发明还提供了所述的质粒载体的构建方法，包括如下步骤：

步骤1：取pIRES-EGFP载体，经BamHI、BstXI双酶切切除IRES，获得线性化载体片段；合成带有BamHI与BstXI酶切位点的P2A片段进行双酶切，获得P2A片段，与所述线性化载体连接，构建获得p2A-EGFP载体；