[发明专利]针对糖原合成激酶（GSK3β）基因V272D突变检测的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术及临床分子诊断技术领域，具体涉及一种针对糖原合成激酶(GSK3β)基因V272D突变检测的试剂盒。

背景技术

Wnt信号通路广泛存在于无脊椎动物和脊椎动物中，是一类在物种进化过程中高度保守的信号通路。Wnt信号在动物胚胎的早期发育、器官形成、组织再生和其它生理过程中，具有至关重要的作用。如果这条信号通路中的关键蛋白发生突变或者异常表达，导致信号异常活化，就可能诱导癌症的发生。Wnt信号通路包括经典的Wnt信号通路与非经典的Wnt信号通路，在经典通路即Wnt-β-catenin信号通路中，Wnt因子通过激活细胞膜上的Frizzle/LRP5/6协同受体后抑制细胞内游离β-catenin蛋白的磷酸化和降解，细胞质中的β-catenin蛋白水平升高后将发生β-catenin蛋白的核移位，导致细胞核中β-catenin蛋白升高，胞核中β-catenin蛋白能够联合Pygo2、Bcl-9以及FoxM1蛋白共同与TCF/LEF-1转录因子家族形成复合体并激活Wnt信号通路下游靶基因的转录激活。

GSK3β蛋白是Wnt信号通路中β-catenin上游重要成员之一，目前越来越多的研究已经发现，在很多肿瘤中GSK3β蛋白均呈现不同程度的突变。

目前研究核心信号通路的核心分子调控机制，以及某些重要成员在细胞中的表达水平，已经成为治疗肿瘤的一种关键手段，虽然近年来Wnt信号通路在癌症中的研究，以及GSK3β蛋白作为Wnt信号通路重要成员其突变水平的研究，已经成为研究开发肿瘤药物急需解决的重要问题，尤其是在GSK3β蛋白激酶结构域中发生的突变，对GSK3β蛋白发挥功能启动非常重要的作用，例如在膀胱癌细胞中检测出V272D突变等。

肽核酸(peptide nucleic acids，PNA)是一类以多肽骨架取代糖磷酸主链的DNA类似物。它是在第一代、第二代反义试剂的基础上，通过计算机设计构建并最终人工合成的第三代反义试剂，是一种全新的DNA类似物，即以中性的肽链酰胺2-氨基乙基甘氨酸键取代了DNA中的戊糖磷酸二酯键骨架，其余的与DNA相同，PNA可以通过Watson-Crick碱基配对的形式识别并结合DNA或RNA序列，形成稳定的双螺旋结构。由于PNA不带负电荷，与DNA和RNA之间不存在静电斥力，因而结合的稳定性和特异性都大为提高；不同于DNA或DNA、RNA间的杂交，PNA与DNA或RNA的杂交几乎不受杂交体系盐浓度影响，与DNA或RNA分子的杂交能力远优于DNA/DNA或DNA/RNA，表现在很高的杂交稳定性、优良的特异序列识别能力、不被核酸酶和蛋白酶水解。

本发明采用特异序列的PNA寡聚物作为探针。由于PNA是一种人工合成的核酸的类似物，并且为非手性、不带电荷的分子，避免了寡核苷酸与其靶基因结合时因电荷相互排斥所导致的杂交不稳定性，结合不易受杂交液离子强度的影响，从而显示出极强的杂交优势，大大提高了检测灵敏度。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中如何确定Wnt信号通路中核心的信号分子GSK3β基因突变情况，以及如何解释核心分子GSK3β在肿瘤细胞中的突变水平变化的困难，提供了一种检测Wnt信号通路中GSK3β基因突变的试剂盒。

本发明提供的试剂盒中包括检测GSK3β基因突变的肽核酸PNA荧光探针(用于特异性检测GSK3β基因V272D突变的肽核酸荧光探针)，通过联合肽核酸PNA荧光探针的PCR方法，能够更加灵敏的检测细胞中GSK3β基因发生的突变，并且为研究Wnt信号通路提供最直接的证据；该试剂盒中还包括：检测GSK3β基因突变所需的与GSK3β基因野生型互补杂交的一段肽核酸PNA探针(用于阻断野生型GSK3β基因扩增的肽核酸探针)、用于定性检测GSK3β基因突变的引物。

本发明的原理是通过构建与GSK3β基因野生型互补的一段肽核酸PNA序列，当肽核酸PNA序列与GSK3β基因互补结合时，任一突变均可导致PNA/DNA产生错配，从而使得溶解温度发生改变。进而根据GSK3β基因突变型设计特异性的肽核酸PNA探针以及引物对GSK3β突变型基因进行荧光定量PCR扩增，经过一轮的PCR扩增后，即可将GSK3β基因突变型与野生型进行区分开来。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

一种针对糖原合成激酶(GSK3β)基因V272D突变检测的试剂盒，它包括以下引物及探针：

用于特异性检测GSK3β基因V272D突变的正向引物GSK3β-F：5'-gtatggtctgctggctg-3'；