[发明专利]一种转猪链球菌2型SLY基因工程菌的保存方法

说明书

技术领域

本发明涉及转基因工程技术领域，具体而言，涉及一种转猪链球菌2型SLY基因工程菌的保存方法。

背景技术

猪链球菌是具有荚膜的一种革兰氏阳性球菌。可根据其细胞壁抗原成分将其大致归类为兰氏分群(Lancefieldgroup D)D群链球菌。根据其荚膜抗原(CPS)的不同，猪链球菌被分为35(1～34型，1/2型)种血清型，其中1，2，7，9型是猪的致病菌。猪链球菌的定植部位为猪的上呼吸道，尤其是扁桃体和鼻腔。部分血清型的猪链球菌具有致病性，主要通过伤口感染。可引起猪的急性败血症(septicemia with sudden death)、脑膜炎(meningitis)、关节炎(arthritis)、心内膜炎(endocarditis)、肺炎(pneumonia)等疾病。部分菌株可引起人类感染，造成细菌性脑炎(bacterial meningitis)或引起中毒样休克综合征(toxic shock-like syndrome)。

因此，对猪链球菌的深入研究和防制在公共卫生方面具有重要意义。在研究猪链球菌的过程中，通常需要利用转基因工程技术对猪链球菌2型的各种基因进行深入研究。需要将导入有外源猪链球菌2型基因的基因工程菌进行保存，以供后期研究、交换和使用等需求。

而菌种在保存过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，这样才能在一定的时间内不发生变异而又保持生物活性。目前比较常用的菌种保存方法包括真空冷冻干燥法、琼脂斜面低温保存法、脱纤维羊血冷冻保存法，液体石蜡保存法。其中真空冷冻保存法效果最好，但对于设备要求高，成本高，制备过程复杂。琼脂斜面低温保存法，操作简便、易于推广，适用范围广，缺点是需经常传代，且易发生污染，保藏期短，而且不适用于对营养要求高的细菌。脱纤维羊血冷冻保存法，这一方法使用的羊血对一般实验室来说不易获得，不能广泛推广使用。液体石蜡保存法，对细菌保存效果差。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种转猪链球菌2型SLY基因工程菌的保存方法，该保存方法可以有效地提高目标工程菌的存活率，延长其保存时间，可长时期地维持工程菌中外源质粒的稳定性以及工程菌自身的活力和纯度，且该保存具有操作简单、成本低等特点。

本发明是这样实现的：

一种转猪链球菌2型SLY基因工程菌的保存方法，其包括：

将保存试剂加入至含目标菌的菌液中，得到目标菌保存液；

将目标菌保存液分装于已灭菌的EP管中，并立即置于-80℃～-20℃条件下进行低温保存；

其中，目标菌为转化有外源质粒的转基因工程菌，外源质粒含有猪链球菌2型SLY基因序列；

保存试剂为含有甘油的生理盐水。

采用甘油-生理盐水保存法，其可以维持工程菌细胞内外的渗透压平衡，避免工程菌因失水或吸水溶胀两种现象而导致的死亡，提高存活率；同时，在生理盐水中加入的甘油可以避免在低温状态下因水分结冰对菌体造成的物理伤害，提高菌体的存活率；而将目标菌保存液置于-80℃～-20℃低温条件保存，可以减缓菌体体内的酶活，降低其新陈代谢，延缓其衰老的时间，进而实现其长期保藏的目的；

小量分装保存可减少菌种传代次数，保证菌种性状稳定，不易变异；并能够缩小贮存空间，确保菌种保存环境安全可靠；减少或避免杂菌污染，操作简便，易于推广，有利于提高生产效率和质量；

总之，本发明提供的保存方法为微生物实验教学和科研单位的菌种保藏工作开展提供依据。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，在保存试剂中，甘油的浓度为20％～60％。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，甘油的浓度可以是20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、65％等中的任一者或任意两者例如20％-25％、25％-30％、30％-35％、35％-40％、35％-40％、40％-45％、45％-50％、50％-55％或55％-60％之间的范围。

具有合适浓度范围的甘油的保存试剂可以使得使用者在保存的过程快速、方便地选取保存试剂的体积与待保存的含目标菌的菌液进行合理搭配，控制甘油的终浓度。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，在目标菌保存液中，甘油的浓度为10％～30％。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，在目标菌保存液中，甘油的浓度为15％～25％。