[发明专利]一种检测乙虫腈的免疫胶体金检测卡及其制备方法

说明书

本发明乙虫腈的免疫胶体金检测卡及其制备方法，涉及动物源食品兽药残留检测技术领域。本发明的检测卡外壳中的试纸条，由PVC胶板、样品垫、胶体金结合垫、包被膜和吸水垫组成；胶体金膜为含乙虫腈单克隆抗体的玻璃纤维素膜，包被膜是硝酸纤维素膜，其上设有T线和C线，T线包被有乙虫腈蛋白质偶联物，C线包被有羊抗鼠IgG抗体。本发明有效用于快速检测乙虫腈，方便、快捷、结果准确。

技术领域

本发明涉及谷物食品中农药残留检测技术领域，特别是涉及乙虫腈的免疫胶体金检测卡及其制备方法。

背景技术

乙虫腈（ethiprole）是一种新型吡唑类杀虫剂，化学名称为5-氨基-1-（2，6-二氯-对三氟甲基苯基）-4-乙基亚磺（硫）酰基吡唑-3-腈基。乙虫腈在环境中的代谢产物主要有：氧化产物RPA097973，为乙虫腈氧化后形成的砜；还原产物RPA107566，为乙虫腈还原后形成的硫化物。乙虫腈悬浮剂可用于水稻、蔬菜等多种作物，能有效防治多种咀嚼式口器和刺吸式口器害虫。随着乙虫腈的广泛施用，其在环境中的讲解归趋及残留状况就成为人们的关注热点。因此，需要发明一种工序少、操作简便检测的新方法。

发明内容

针对以上情况，本发明的目的就是为了克服现有技术存在的缺陷而提供一种乙虫腈的免疫胶体金检测卡及其制备方法，可有效解决能快速、简便地检测出乙虫腈的问题。

本发明的乙虫腈胶体金检测卡，包括包被了单克隆抗体胶体金标记物的胶体金结合垫、包被了乙虫腈-BSA和羊抗鼠IgG的硝酸纤维素膜、样品垫、吸水垫、PVC胶板和塑料模具组成，在PVC胶板的一端依次粘附样品垫、结合垫，中间黏贴硝酸纤维素膜，另一端粘附吸水垫。

本发明的乙虫腈胶体金检测卡的制备方法，是由以下步骤实现：

(1)胶体金溶液制备：取1 L 三角烧瓶1个，加入超纯水495 mL，而后加入1%氯金酸(HAuCl₄·3H₂O) 5 mL，配制成500 mL 0.01%氯金酸水溶液，加热煮沸后在持续搅拌的情况下加入1%柠檬酸三钠(Na₃C₆H₅O₇·2H₂O)溶液5-7 mL，继续搅拌加热，当溶液的颜色完全变为透明的紫红色时，维持5 min后停止加热，补水至原体积，冷却至室温，2-8℃保存备用；

(2)抗体的预处理：将要标记的乙虫腈抗体在1000 r/min, 4℃条件下，离心20 min，取上清，用0.01 mol/L PBS稀释成1 mg/mL；或者用0.01 mol/L PBS稀释成1 mg/ml，过0.22 µm滤膜；

(3)胶体金标记物的制备：取步骤(1)中的胶体金溶液40 mL，用0.25 mol/L K2CO3调节胶体金溶液pH至 8.5，电磁搅拌器250 r/min搅拌，逐滴加入4 mL 含0.3 mg 抗体蛋白的蛋白溶液，反应10 min；逐滴加入4 mL 10% BSA，继续搅拌反应10 min；金标抗体溶液常温低速（1500 r/min）离心10 min，弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀；红色上清溶液4℃，12000r/min 离心20 min，弃上清，收集沉淀，将沉淀用金标抗体稀释液定容至1 mL，制备成乙虫腈单克隆抗体胶体金标记物；

(4)胶体金膜的制备：将步骤(3)乙虫腈蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物用划膜仪以5 µL/cm的浓度均匀喷在载体玻璃纤维素膜上，室温自然晾干或者37℃烘干3 h，制成含乙虫腈蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物的胶体金膜；

(5)包被膜制备：将羊抗鼠IgG抗体、乙虫腈蛋白质偶联物稀释成1 mg/mL，用划膜仪依次以1 µL/cm的浓度喷涂在硝酸纤维素膜上，制备成包被膜，37℃包被2 h后，室温自然晾干或者37℃烘干；

(6)样品垫前处理：将样品垫处理液均匀涂布在玻璃纤维素膜上，在空气湿度低于60%的条件下，室温自然晾干；