[发明专利]一种检测螺旋霉素残留的试纸条

说明书

本发明提供了一种检测螺旋霉素的胶体金免疫试纸卡，包括反应膜、样品垫、金标垫、吸水垫和PVC板，在所述反应膜上具有包被有螺旋霉素半抗原‑载体蛋白偶联物的测试区和包被有羊抗鼠IgG的质控区，所述结合物释放垫包被有螺旋霉素单克隆抗体‑胶体金标记物。本发明还提供了一种应用上述试纸卡检测螺旋霉素的方法，它包括步骤：首先进行样本前处理，然后用试纸卡进行检测，最后分析检测结果。本发明提供的试纸卡可用于检测动物源性食品如鸡肉、饲料中的螺旋霉素药物残留量，其操作简单、灵敏度高、检测速度快、成本低，能够现场监控，满足大量样本筛查的需要。

技术领域

本发明涉及胶体金酶联免疫快速检测，具体涉及一种检测螺旋霉素药物残留的胶体金试纸条，能够实现快速检测螺旋霉素药物的残留。

背景技术

螺旋霉素（Spiramycin，简称SPM）是大环内醋类抗生素含有三个组分，并具有三个糖基，分别为碳霉氨糖、富乐氨糖、碳霉糖。螺旋霉素属大环内酯类抗生素，对葡萄球菌、化脓性链球菌、肺炎链球菌等有抗菌作用，并在高浓度下，具有杀菌作用。针对的菌群主要是细菌类，对真核微生物就起不到该有的抗菌作用。进一步的研究表明，低剂量的大环内酯还具有良好的促生长作用，所以，在畜牧业生产中大环内酯类药物也是一种重要的药物添加剂，甚至有些大环内酯类药物已成为畜禽专用的药物。但是，作为兽药，如果使用量和停药期控制不好，其在食用活动物的组织、奶等最终产品中就会出现残留，从而对食用该类产品的消费者和环境造成不利的影响。国际食品法典委员会、欧盟以及日本均规定该药物的最高残留限量值为200μg/L；因此，在实践中，需要一种精确度、灵敏度高的检测螺旋霉素方法。

发明内容

本发明的目的在于能够提供一种敏感度高、操作简便、成本低廉的快速检测螺旋霉素药物残留试纸卡检测方法。

本发明的试纸卡由反应膜、样品垫、金标垫、吸水垫和PVC板五部分构成，在上述反应膜分别包被有螺旋霉素半抗原-载体蛋白偶联物的检测区和包被有羊抗鼠IgG的质控区，所述金标垫包被有螺旋霉素药物单克隆抗体-胶体金标记物。

上述螺旋霉素半抗原-载体蛋白偶联物由螺旋霉素半抗原与载体蛋白偶联得到，所述螺旋霉素药物单克隆抗体-胶体金标记物由螺旋霉素免疫原免疫动物筛选获得，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、蓝血蛋白、人血清蛋白，所述羊抗鼠IgG是将鼠源抗体免疫羊得到。

本发明中包括半抗原合成、抗原、螺旋霉素单克隆抗体制备过程：

1、半抗原合成

称取5g螺旋霉素溶于适量吡啶，加入6-8g丁二酸酐，75℃反应6-12h，TLC检测反应过程，当TLC显示原料消失后停止反应，用6mol/L HCl调节溶pH=4-6，用乙酸乙酯进行提取，收集有机相，用1mol/L盐酸进行洗涤，再用水洗至洗涤液pH=5-7，将有机相用无水硫酸钠干燥，减压蒸馏，产品用硅胶柱层析提纯。收集反应液TLC检测显示中最先出现的主要点组分。减压蒸馏去除溶剂得螺旋霉素半抗原。技术路线如下所示：

2、抗原的合成及鉴定

(1) 包被原的合成

称取35mg 螺旋霉素半抗原用1mL二甲基甲酰溶解。冷却至10℃，加50μL氯甲酸异丁酯，10℃搅拌反应30 min。150mg卵清蛋白、人血清白蛋白或血蓝蛋白用2mL 50mmol/L碳酸钠缓冲液。10℃反应4 h，然后4℃过夜。冷冻干燥，-20℃保存。

(2) 免疫原的合成

取EDC150mg，用pH8.0 的10mmol/L PB缓冲液1.5mL 使之充分溶解(I 液)。取螺旋霉素半抗原30mg，用0.2mol/L NaOH 溶液2ml 溶液溶解(II 液)。取BSA 150mg，溶于3mL10mmol/L PB缓冲液(pH8.0) 液中 (III 液)。