[发明专利]一种检测群勃龙残留的酶联免疫试剂盒

说明书

本发明提供了一种检测群勃龙残留的酶联免疫试剂盒制备及检测方法，它包括：包被有包被原的酶标板、酶标二抗、群勃龙特异性抗体工作液、群勃龙标准品溶液、底物显色液、终止液、浓缩洗涤液和浓缩复溶液。本发明提供的酶联免疫试剂盒用于畜禽中群勃龙的残留量检测，该试剂盒具有检测简单快速、检测结果精确、检测成本低、灵敏度高等特点，可在群勃龙残留现场检测中发挥重要作用。

技术领域

本发明涉及到酶联免疫检测方法，具体涉及检测组织、尿样中群勃龙残留的酶联免疫试剂盒及其检测应用。

背景技术

群勃龙(Trenbolon，TR)化学名去甲雄三烯醇酮，分子式为C₁₈H₂₂0₂，分子量为270，熔点170℃。群勃龙是应用比较广泛的甾类同化激素，所谓蛋白同化激素,是一种能够够促进细胞的生长与分化，使肌肉扩增，甚至是骨头的强度与大小的多体激素。它由天然来源的雄性激素如翠酮等经结构改造，降低雄激素活性，提高蛋白同化活性而得到的半合成激素类药物。

在畜禽疾病控制和治疗起到重要作用。随着畜牧业规模化、集约化发展，少数生产企业及饲养者、经营者为谋取最大利润，置国家法律法规于不顾，滥用或非法使用激素等违禁药品。作为同化激素类添加剂的群勃龙饲养家畜，可使营养成分从脂肪组织向肌肉组织转移，使瘦肉增加。但却常常造成群勃龙在动物源性食品中残留超标。当人们食用了残留超标的动物性食品后，会在人体内蓄积产生头痛、胸闷、心悸、肌肉疼痛等中毒症状，严重干扰人体的自然激素平衡,导致异性化现象，还可能严重损伤肝、肾、心血管系统及生殖系统，并可使人产生药物依赖，少数人还可能出现严重的情感及精神病症，甚至导致基因突变，诱发恶性肿瘤，直接危害人的健康及生命。基于以上危害,中华人民共和国农业部2002年颁布的235号文件规定在动物源性食品中也不得检出。另外，年欧盟对我国畜禽产品提出了个种类的兽药残留、抗生素检测监控要求，其中明确指出，动物源性食品药物残留中，群勃龙不得检出。

发明内容

本发明拟提供一种专门针对群勃龙残留检测的试剂盒，采用间接竞争ELISA方法，并提供一种高效、准确、简便、满足大批量样本筛选的定性、定量检测和试剂盒制备方法，该方法对组织最低检测限为2.3μg/kg，饲料最低检测限为2.5μg/kg，尿液的最低检测限为2.5μg/L。

本发明所述的群勃龙残留检测试剂盒，其主要包含以下试剂：包被群勃龙偶联抗原的酶标板、群勃龙药物标准溶液、酶标二抗、群勃龙单克隆抗体工作液、底物液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液所组成。

本发明所述试剂盒，以群勃龙半抗原制备方法作为基础，该方法以群勃龙乙酸酯为原料，经丁二酸酐法两步反应即可获得半抗原，合成方法工艺简单，分子结构式为式Ⅰ所示：

（式Ⅰ）。

本发明的群勃龙半抗原合成路线如下所示：

称取5g群勃龙乙酸酯原料溶于50-100mL乙醇，加入0.5-1g盐酸羟胺和10mL 6mol/L的氢氧化钠溶液，80℃回流反应，TLC法检测反应情况，4-6h反应完全，除去乙醇，往剩余反应液中加入5-10mL去离子水，用石油醚提取三次，每次10mL，取水相用2mol/L盐酸进行酸化，调pH=6.0-7.0，再用乙酸乙酯提取，直到提取液中检测不出紫外点，用饱和食盐水和水分别洗涤后干燥，得中间体产品。中间产物技术路线如下所示：

将上一步制备的中间体产品溶于适量吡啶中，加入20-50mL丁二酸酐，50℃反应过夜，TLC检测反应结果，反应结束后，用HCl调节溶液pH=5.0-5.5，再用乙酸乙酯提取，干燥。剩余物用硅胶柱层析提纯，得群勃龙乙酸酯衍生物。将其溶于50mL甲醇:水=1:5-10溶液，加入适量氢氧化锂，室温反应2-4h，将反应液石油醚提取三次，每次10mL，取水相，缓慢往其中滴加2mol/L盐酸，出现大量白色固体，即为群勃龙半抗原产物。技术路线如下所示：