[发明专利]一种莪术茎尖玻璃化超低温保存及解冻方法

说明书

本发明公开了一种莪术茎尖玻璃化超低温保存及解冻方法，主要包括丛生芽诱导培养、继代培养、预培养、装载液处理、玻璃化保护液处理、迅速冷冻以及解冻处理等步骤。本发明建立起莪术种质资源的超低温保存的技术程序，填补了莪术茎尖超低温保存技术的空白；本发明所采用的冰冻保护剂成本低、毒性低，冷冻介质液氮性质稳定、容易制得和价格便宜，且超低温保存操作简单，减少了在各项操作过程中对茎尖的机械损伤，经保存后的茎尖生活力仍然可高达79％，一次保存可以长期稳定存放，简化传统种植和组培育苗需要频繁继代的繁琐操作。本发明提供的解冻方法操作简单，使细胞在解冻过程中未受到机械损伤，莪术茎尖的生活力未受影响。

技术领域

本发明涉及植物种质低温保存技术领域，尤其涉及一种莪术茎尖玻璃化超低温保存及解冻方法。

背景技术

莪术(Curcumazedoaria(Christm.)Rosc.)，姜科(Zingiberaceae)姜黄属(Curcuma)的多年生草本植物，其根茎为中药莪术，可入药，有消食，行气解郁，止痛破淤，治疗妇女血淤闭经等功效。莪术的姜黄素和挥发油具有抗氧化和抗肿瘤等药理活性。姜黄素是美国肿瘤研究所指出的对癌症有预防作用的第3代药物。萜类化合物能诱导细胞周期停滞或者凋亡、抑制癌细胞转移和侵袭等。由莪术的药理作用来看，对莪术资源的开发前景非常可观，但目前对莪术种质资源的保种育种方法主要有传统育种和组培育种。传统育种保存种质需要耗费大量人力、物力、财力和占用大面积种植地，且容易受自然灾害、病虫害的影响，长期的种植会引起种质资源退化以及变异，导致优种质资源丢失等；组培育种保存需要频繁进行继代培养，容易造成样品污染和试管苗变异等。因此，探索一种适用于莪术种质资源长期保存的新途径具有十分重要的意义。

超低温保存是指在-100℃以下保存生物材料的方法，具有设备简单，容易操作，稳定性好，一次处理可以长期保存等诸多优点，在保存植物种质资源方面，有无可比拟的优势。文献报道，人类早在1897年就有了用-192℃的液态空气处理植物种子的尝试，由于液氮具有性质稳定、容易制得和价格便宜等特点成为了常用的超低温保存冷冻介质，经过多年的发展，已有用液氮保存植物的繁殖器官、营养器官、组织培养物、顽拗性或中间型种子等作为材料进行超低温保存的先例。目前，已在药用植物、果树以及园艺作物等方面有研究，如白木香、益智、高良姜、降香黄檀、决明、洋蓟、苹果、梨、大蒜、生姜、土豆等植物。植物品种不同，其组织特性、含水量以及对超低温的耐受程度不同，这种差异甚至存在于同种植物的不同亚种之间，所以想用一种方法保存所有的植物是很难办到的，这就要求超低温处理试验针对不同植物品种分别建立合适的处理方法，目前尚未见有关于莪术种质资源的玻璃化超低温保存的报道。

由于茎尖分生组织分化程度小，在植物保存后的再生过程中，比其他细胞培养物的遗传性稳定，所以茎尖分生组织是超低温保存的一种理想材料。但是植物茎尖超低温保存受到的影响因素很多，例如超低温处理需要对茎尖进行脱水、干燥、将茎尖置于-100℃以下的液氮中以及采用毒性溶剂，这些操作必然对茎尖造成损伤，杀死茎尖细胞，不仅降低其存活率，而且延长其复苏时间。

发明内容

本发明提供一种莪术茎尖玻璃化超低温保存及解冻方法，通过对莪术茎尖进行系统的超低温保存研究，建立了一套适用于莪术种质资源的超低温保存技术体系，为莪术种质资源长期稳定保存提供新途径，为莪术资源的开发、研究及利用提供科学依据。

本发明采取的技术方案如下：

一种莪术茎尖玻璃化超低温保存方法，包括以下步骤：

S1：切取莪术块茎上萌发的嫩芽，洗净后进行预处理，然后接种到丛生芽诱导培养基上，在培养箱中培养至长出丛生芽；

S2：切取莪术组培苗带芽茎段，在丛生芽诱导培养基上进行15～60天的继代培养；

S3：切取莪术茎尖，在黑暗条件下用含0.3～0.7mol/L蔗糖的MS固体培养基分别预培养1～7天后，进行后续装载处理；