[发明专利]一种免疫组化检测NAP2在肝癌和癌旁组织中表达方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因转录组学和蛋白质组学领域，尤其是一种免疫组化检测NAP2在肝癌和癌旁组织中表达的初步方法。

背景技术

由于原发性肝癌早期一般无任何症状，一旦出现临床表现，病情大多已进入中、晚期，而且恶性程度高、进展快、预后差、侵袭性强，因此，寻找有效的肿瘤标志物用于癌变机理研究、药物靶标的设计、疾病的早期诊断及高危人群的筛查成为广西地区肝癌研究的当务之急。

目前，肝癌的发现和诊断是通过血清AFP检测结合影像学检查。其中临床较为公认的肝癌诊断标准为：血清AFP浓度>400μｇ/L，持续4周，影像学发现肝脏有实质性占位且能排除肝炎活动、生殖胚胎性肿瘤等疾病。但仅依靠血清AFP浓度来诊断肝癌，灵敏度为39%~64%之间，特异度为76%~91%，阳性预测值只在9%～32%，这就使得很多肝癌患者漏检，或假阳性和假阴性，直接影响肝癌患者的早期诊断和治疗。

随着生物技术的迅猛发展及人类基因组计划(HGP)全基因组测序的完成，人类进入了后基因组时代，其中蛋白质组学的研究越来越受到人们的关注。用蛋白质组学技术来检测、分析和确定标志蛋白和靶蛋白，阐明肿瘤蛋白表达水平的变化与肿瘤发生发展不同阶段的相互关系及其规律，是目前解决肿瘤早期诊断难题的最有利的途径；同时，也是肿瘤及其药物筛选研究中最新并且最强有力的手段。

质谱技术是蛋白组学技术中筛选、鉴定特异性肿瘤标志物的核心，常用的是表面增强激光解析/离子化飞行时间质谱技术（surface-enhanced laserdesorption/inionation-time of flightmass spectrometry，SELDI-TOF-MS）和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix-Assisted Laser Desorption/ Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF-MS）。本课题组曾利用SELDI-TOF-MS结合液质联用HPLC/MALDI-TOF-MS技术对乙肝相关的肝癌、慢性良性肝病、正常人的血清样品进行分析，得到人类乙肝相关肝癌的特异性血清标志物NAP2（71）和NAP2（73）。利用与SELDI有着相似的检测原理但重复性较好的CLINPROT系统，在肝癌与正常人两组血清样品中筛选到两个差异明显的蛋白质多肽，一个鉴定为来自纤维蛋白原（Fibrinogen）的一个分泌片段，纤维蛋白肽A（Fibrinopeptide A），这与Eduard等的结果完全一致；另一个多肽鉴定为激肽原（Kininogen）。而近两年来新发展的iTRAQ（isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ）标记结合MALDI-TOF MS/MSF技术，建立在iTRAQ同位素标记试剂的基础上，包括一个带电荷的报告基团，另外还有一个肽段反应基团和一个平衡基团，其中平衡基团平衡分子量，保证与每一种报告基因结合后iTRAQ试剂总的相对分子量都是145，肽段反应基团可以同肽段的N末端和赖氨酸测量E氨基基团发生反应，这样可以标记生物样品中产生的所有肽段，增强任一给定蛋白的肽段覆盖度，同时保留了诸如一些蛋白的翻译后修饰的重要结构信息，为疾病标志物的发现与鉴定提供了定量信息，使得课题组在肝癌新标志物的筛选方面更为如虎添翼。

自2005年起，本课题组经上述质谱技术筛选肝癌特异性标志物，取得的一系列研究成果，这些功能蛋白质和潜在疾病蛋白质标志物的发现和鉴定得益于差异蛋白质组学研究的发展，但如何进一步探测这些蛋白质的表达丰度，以阐明其功能和在疾病研究中的意义，已变得越来越重要。目前，标志物发现- 验证- 临床确证的研究模式已得到研究者们的广泛认可。即在发现阶段从疾病生物样本中寻找与正常样本有差异的蛋白质；到验证阶段对筛选出来的标记物定量，评估其准确性、特异性、范围等，并把被验证的标志物与临床特征、结果相联系；将验证阶段找出的最有可能成为生物标志物的候选分子，进入下一步临床确证。这种研究模式使体液中生物标志物的发现和验证更为有效、科学和合理。