[发明专利]一种鉴定菊花耐涝性的dCAPS标记开发及应用

权利要求书

1.一种鉴定菊花耐涝性的dCAPS标记的筛选方法，其特征在于包括以下步骤：

a、通过GWAS方法挖掘与菊花耐涝性显著关联的SNP位点

选取多份来源不同且无直接亲缘关系的菊花品种，采用盆栽模拟淹水法对该群体进行了三次耐涝性鉴定，获得表型数据；基于已有的SNP标记数据分别采用ADMIXTURE软件和SPAGeDi软件对该群体进行分析，获得群体结构Q矩阵和亲缘关系系数K矩阵；在TASSEL 5.0软件中，根据三次耐涝鉴定试验表型数据的平均值，利用GLM和MLM两种分析模型进行全基因关联分析，以两种模型均能检测到的P1E-3的显著SNP位点为与菊花耐涝性紧密关联的位点，同时得出该标记的贡献率R²；

b、SNP突变位点特异性酶切位点分析及dCAPS引物设计

（1）从步骤a所得的与菊花耐涝性紧密关联的位点中，选择P值最小，且贡献率较大的SNP位点进行后续dCAPS标记开发；

（2）利用在线酶切识别软件dCAPS Finder 2.0查找步骤（1）中所选择的SNP位点突变所引起的限制性内切酶信息，选用合适的内切酶，且人工引入错配碱基；

（3）利用Primer Primer 5.0 软件设计PCR引物，引物设计标准为18-25bp；GC含量40-60%；退火温度为55℃-65℃，且上下游引物的GC含量和退火温度尽量保持接近；无引物二聚体及发卡结构；

步骤b的（1）中选择的P值最小且贡献率较大的SNP位点为标签Marker6619的75 bp位置处的SNP位点（Marker6619-75）；

步骤b的（2）中选用识别序列为GCTAGC的内切酶NheI，在Marker6619-74处引入错配碱基（T→C），步骤b的（3）中设计的引物序列分别为：

F 5’-ATGCACAAGGCATTGGTCTTGC-3’；

R 5’-CCTCAAAGTTTTGGCTATTCTCC-3’；

标签Marker6619的序列为：

CACCATTTCTTCTTCAGTGGACATTTCCGAACTATCTATTTCTAACGTCTCAATGCACAAGGCATTGGTCTTGT[Y/C]AGCAGCACTAGCAGAAAGACTTGCANNNNNNNNNNTGAATTCTGATGTATTCACAATCTTTAACTTCTTCTGTGGAGAATAGCCAAAACTTTGAGGTAAATTAAATTTGTCTTTATCATATTCATAACCATTTCG；

c、结合基因型与表型数据预期酶切扩增多态性

对步骤b中选择的SNP位点在该群体进行基因型分析，对选择的SNP位点的基因型分别计算平均表型值，并用Student’s t检验方法分析耐涝差异显著性，结合基因型与表型值预期酶切扩增多态性；

d、dCAPS标记在自然耐涝极端群体的验证

（1）提取多份耐涝菊花品种材料和多份不耐涝菊花品种材料的基因组DNA，用上述步骤b中设计的特异引物对耐涝菊花品种材料和不耐涝菊花品种材料进行PCR扩增，获得目的片段全长；

（2）将扩增产物用步骤b中选用的内切酶进行酶切，并对酶切产物进行电泳检测、银染法染色；酶切扩增多态性分析，如果检测结果与步骤c中的预期相符，则将该SNP位点作为鉴定菊花耐涝性的dCAPS标记，将该标记命名为WT-dCAPS1标记；

e、在F₁后代耐涝极端群体中对WT-dCAPS1标记进行进一步验证

选取耐涝性菊花品种和不耐涝性菊花品种进行杂交，在F₁杂交群体中选择极端耐涝株系和极端不耐涝株系进一步验证所筛选的WT-dCAPS1标记。