[发明专利]一种延长白菜小孢子胚状体再生植株继代间隔时间的方法

说明书

技术领域

本发明涉及属于生物技术领域，尤其涉及一种延长白菜小孢子胚状体再生植株继代间隔时间的方法。

技术背景

白菜是我国人民生活中主要的食用蔬菜之一，长期以来深受广大群众喜爱。为培育新的种质资源，育成优质白菜品种，常规方法需要经过杂交、回交和自交分离，选育出理想的材料常常需要好几个世代，而利用小孢子培养技术，不仅可快速得到双单倍体纯系，还可大大缩短育种年限，随着国内外利用游离小孢子培养技术在芸薹属作物育种的研究中相继取得突破，也为此技术在实际中应用提供了基础。

利用小孢子培养技术能缩短育种年限，但在具体操作中却存在要对胚状体再生植株进行多次继代转接再培养以保持其活性从而满足现实躲过炎热夏季入土栽培时间的问题，继代转接要耗费大量的人力和时间，所以建立一种延长继代间隔时间的方法就非常重要，而延长继代间隔时间则主要通过延缓植株在培养基中生长速度及培养基干枯时间来实现。通过研究发现，培养基的成分含量、培养温度、光照强度及光周期等因素均可对植株生长速度及培养基干枯时间产生影响，本发明通过对以上因素进行优化，进而实现延长继代间隔时间的目的。

发明内容

一种延长白菜小孢子胚状体再生植株继代间隔时间的方法，所使用的继代培养基为：含有绵白糖20～30g/L，6-BA 0.15～0.25mg/L，NAA 0.35～0.45mg/L，琼脂粉8～10g/L，卡那霉素(Kan)0.1～0.2mg/L，pH值为5.5～6.5的MS培养基；培养基分装量为每100mL三角瓶装入70～80mL。

进一步地，具体操作步骤为：(1)将由胚状体形成的再生植株转接入含有上述培养基的三角瓶中。

(2)在20±2℃，光照强度2000～3000lx，光周期12h/12h的条件下培养7～10d。

(3)将第(2)步接种再生植株后的三角瓶移入2～8℃冷藏箱中放置，待培养基含量下降至10～20mL时取出，继而进行下一次的继代转接操作。

进一步地，可使继代间隔时间达到70～90d，是常规培养继代间隔时间的2～3.5倍。

附图说明

图1为白菜胚状体再生植株继代间隔时间对照表。

图2为白菜胚状体再生植株继代间隔时间对照表。

具体实施方式

选取白菜小孢子不同基因型胚状体再生植株，在四个成分含量不同的继代培养基中培养，培养基分别为：

1号：含有绵白糖20～30g/L，6-BA 0.15～0.25mg/L，NAA 0.35～0.45mg/L，琼脂粉8～10g/L，卡那霉素(Kan)0.1mg/L，pH值为5.5～6.5的MS培养基；

2号：含有绵白糖30～40g/L，6-BA 0.25～0.35mg/L，NAA 0.35～0.45mg/L，琼脂粉8～10g/L，卡那霉素(Kan)0.1mg/L，pH值为5.5～6.5的MS培养基；

3号：含有绵白糖20～30g/L，6-BA 0.15～0.25mg/L，NAA 0.25～0.35mg/L，琼脂粉6.5～7.5g/L，卡那霉素(Kan)0.2mg/LpH值为5.5～6.5的MS培养基；

4号：含有绵白糖30～40g/L，6-BA 0.25～0.35mg/L，NAA 0.25～0.35mg/L，琼脂粉6.5～7.5g/L，卡那霉素(Kan)0.1mg/L，pH值为5.5～6.5的MS培养基；

培养基分装量为每100mL三角瓶装入70～80mL，将再生植株转入培养基后，在20±2℃，光照强度2000～3000lx，光周期12h/12h的条件下培养7d～10d后，移入2～8℃冷藏箱中放置，待培养基含量下降至10～20mL时取出(如出现培养基干裂严重要提前取出)。统计从再生植株转接入培养基至从冰箱中取出的时间，结果见表1，

选取白菜小孢子不同基因型胚状体再生植株，选用继代培养基为含有绵白糖20～30g/L，6-BA0.15～0.25mg/L，NAA0.35～0.45mg/L，琼脂粉8～10g/L，卡那霉素(Kan)0.1mg/L，pH值为5.5～6.5的MS培养基，分别在三个不同培养条件下进行培养，条件分别为：

A.温度20±2℃，光照强度2000～3000lx，光周期12h/12h，培养7d～10d移入2～8℃冷藏箱中放置，待培养基含量下降至10～20mL时取出。

B.温度25±3℃，光照强度3000～4000lx，光周期16h/8h，培养7d～10d移入2～8℃冷藏箱中放置，待培养基含量下降至10～20mL时取出。