[发明专利]一种PCR-LF技术检测碳青霉烯类耐药基因KPC和NDM的引物组合物及其应用

权利要求书

1.一种用于多重PCR结合胶体金免疫侧流层析技术检测碳青霉烯类耐药基因KPC和NDM的引物组合物，其特征在于：所述引物组合物包含：用于检测KPC基因的上游引物如SEQ IDNo.1所示，下游引物如SEQ ID No.2所示；用于检测NDM基因的上游引物如SEQ ID No.3所示，下游引物如SEQ ID No.4所示；其中用于检测KPC基因的上游引物5’端标记生物素，下游引物3’端标记地高辛；用于检测NDM基因的上游引物5’端标记生物素，下游引物3’端标记FAM。

2.一种用于多重PCR结合胶体金免疫侧流层析技术检测碳青霉烯类耐药基因的A类碳青霉烯酶基因KPC和B类碳青霉烯酶基因NDM的检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒中包含权利要求1所述的引物组合物。

3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中引物浓度均为0.1 μM。

4.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包含阳性标准品、阴性标准品、TaqDNA聚合酶、酶扩增八连反应管；所述的阳性标准品由KPC标准品和NDM标准品组成。

5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于：所述的KPC标准品或NDM标准品是以KPC基因或NDM基因为目的基因，通过与pUCm T载体连接转化进行克隆，用于多重PCR的阳性标准品。

6.权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于：所述的阴性标准品为无碳青霉烯类耐药基因的核酸提取液的无菌去离子水。

7.一种非疾病诊断目的的用于检测碳青霉烯类耐药基因KPC和NDM的多重PCR结合胶体金免疫侧流层析技术方法，其特征在于，步骤如下：

（1）提取待测样本DNA；

（2）利用权利要求1所述的引物组合物，进行多重PCR扩增；30 μL扩增体系中 Taq DNA聚合酶15μL、上、下游引物各0.3μL、阳性标准品5μL、阴性标准品5μL、待测菌液DNA 5μL、无菌去离子水补足至30μL；反应条件：95℃ 5 min预热，30个循环包括94℃ 40s变性，60℃40s，72℃ 1min，最后72 ℃延伸5 min；

（3）胶体金免疫侧流层析检测，并读取结果。

8.权利要求7所述的非疾病诊断目的的用于检测碳青霉烯类耐药基因KPC和NDM的多重PCR结合胶体金免疫侧流层析技术方法，其特征在于，PCR多重扩增产物采用胶体金免疫侧流层析试纸条进行检测，结果若同时出现质控线、KPC检测线、NDM条检测线均为红色，则待测样品中含有KPC基因和NDM基因；结果若出现质控线、KPC检测线为红色，则待测样品中含有KPC基因；若结果质控线、NDM检测线为红色，则待测样品中含有NDM基因；若结果只有质控线为红色，则待测样品结果为阴性。