[发明专利]专一高效识别谷胱甘肽适体GSH及其衍生物

说明书

1.技术领域

本发明属于氨基酸检测技术领域，涉及一种核酸，特别是涉及高特异性和高亲和力的谷胱甘肽核酸适体及其制备方法。

背景技术

谷胱甘肽(glutathione,r-glutamyl cysteingl +glycine,GSH)是一种含γ-酰胺键和巯基的三肽，由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸组成。存在于几乎身体的每一个细胞。谷胱甘肽能帮助保持正常的免疫系统的功能，并具有抗氧化作用和整合解毒作用，半胱氨酸上的巯基为其活性基团（故常简写为G-SH），易与某些药物（如扑热息痛）、毒素（如自由基、碘乙酸、芥子气，铅、汞、砷等重金属）等结合，而具有整合解毒作用。谷胱甘肽具有广谱解毒作用，不仅可用于药物，更可作为功能性食品的基料，在延缓衰老、增强免疫力、抗肿瘤等功能性食品广泛应用。

目前常用的谷胱甘肽的检测方法有三大类：色谱法、免疫学法、循环酶法。色谱法灵敏度高、特异性好，但样品处理、分离条件、色谱柱制备诸多变异，使其难以标准化；而且HPLC设备价格昂贵、技术条件要求高，需专门的维护人员，使其推广困难。免疫学法需要还原游离GSH形式，抗体荧光分析法和比浊法不能直接检测游离型谷胱甘肽，只能检测血浆总谷胱甘肽，用还原剂在37℃半小时卵育对血样进行还原处理。免疫学法需一小时以上才能出结果，操作步骤繁琐，因为需要进行还原处理可受一些不确定的因素影响。循环酶法过程繁琐，且检测限低、产生误差较大，价格昂贵，故得不到推广。

核酸适配体是近年发展起来的一类新型识别分子，近年来受到科学家的广泛关注，大量针对重要生理活性分子的核酸适配体被筛选出来；各种基于核酸适配体的分析方法和技术已被报道；核酸适配体药物“Macugen”也已于2005年被FDA正式批准上市。SELEX技术筛选得到的寡核苷酸序列被称为适配子, 国内其翻译为核酸适体、核酸适配子、核酸识体或核酸适配体等。SELEX 技术是指应用化学法合成大容量的随机寡核苷酸(由两端的固定序列和中间的随机序列组成) 文库,通过施加选择压力(结合靶目标，淘选与靶目标高度特异结合片段的过程), 并结合体外扩增技术, 经过多轮的循环选择富集, 获得与靶物质高度特异结合的寡核苷酸分子, 可以是RNA 也可以是DNA, 长度一般为25~ 60 个核苷酸。

由上可知，核酸适体与靶物质结合所呈现的高敏感性和高特异性, 使其在疾病诊断中具有良好的应用前景, 尽管目前成熟的临床应用报道较少, 但应用适体检测氨基酸的研究却不断增多, 基于适体的检测新技术也不断出现。但是目前基于核酸适体的针对于谷胱甘肽的高效特异性识别研究还很缺乏，且针对于谷胱甘肽的核酸适体及其筛选制备方法尚未见有报道。

2.发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有的谷胱甘肽检测技术的不足，填补还未见谷胱甘肽的核酸适体及其筛选制备方法空白，提供一种谷胱甘肽核酸适体及其制备方法，本发明所提供的核酸适体命名GSH2。

本发明的方案是通过这样实现的：一种谷专一高效识别谷胱甘肽适体GSH，所述核酸适体的核苷酸序列其序列为：aaacgggagg agcatatgct ctggtaag。

以上所述专一高效识别谷胱甘肽适体GSH的衍生物，所述衍生物包括以下四种中的任意一种：

（1）将权利要求1中所述核酸适体任意位置上的碱基A、T、C或G置换成稀有碱基甲基化嘌呤、二氢尿嘧啶或次黄嘌呤后，得到的核酸适体衍生物；

（2）权利要求1中所述核酸适体的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架；

（3）权利要求1中所述核酸适体改造成的肽核酸；

（4）权利要求1中所述核酸适体改造成的锁核酸。

一种以上所述专一高效识别谷胱甘肽适体GSH或其衍生物在识别、检测谷胱甘肽，或者制备检测谷胱甘肽的试剂盒方面的应用。

为了使本发明公开充分，本发明专一高效识别谷胱甘肽适体GSH的制备方法步骤如下：

谷胱甘肽核酸适体的制备方法包括以下步骤：

1） 合成单链DNA随机序列寡核苷酸库：所述单链DNA随机寡核苷酸库的两端为固定序列，作为PCR扩增引物结合区，中间为60个碱基的随机序列，库容量10¹⁵以上。所述PCR引物为：

引物1：5’-ATACCAGCTTATTCAATT-3’

引物2：5’-Biotin-AGATTGCACTTACTATCT-3’

所述PCR引物2带有5’端生物素标记。