[发明专利]一种鲨鱼抗体来源的蛋白骨架及其应用

说明书

本发明涉及一种蛋白骨架，其特征在于以下结构：A‑B‑C，其中结构单元A表示序列RVEQTPTTTTKEAGESLTINCVLKGSSCALGSTYWYFTKKGATKKASLSTGGRYSDTKNTASKSFSLRISDLRVEDSGTYHCEAY(SEQ ID NO：1)；结构单元B表示抗体可变区；结构单元C表示EGGGTILTVK(SEQ ID NO：2)，其中结构单元A，B和C以肽键连接。

技术领域

本发明涉及鲨鱼抗体来源的蛋白骨架及其应用。

背景技术

所谓蛋白骨架包括典型的大分子抗体【比如IgG，IgM等】，骆驼抗体、羊驼抗体和鲨鱼抗体等小分子抗体，以及Affibody和DARPin等非抗体小分子蛋白骨架。这些蛋白骨架可以是一种完整的天然蛋白，一种天然蛋白的部分结构域，两种或两种以上天然蛋白的部分结构域的融合蛋白。这些蛋白骨架的共同特征是，在其个别区域允许突变，适合构建大容量合成蛋白骨架突变文库。可以采用噬菌体展示等筛选技术，从这些突变文库中筛选与靶分子结合的蛋白骨架分子。在众多的蛋白骨架中，小分子蛋白骨架尤其重要。小分子蛋白骨架的体积小，可以在与靶分子相互作用时，作用于大分子抗体无法接触的沟回表位；小分子蛋白骨架可以构建多价分子，提高中和靶分子的能力，提高潜在药效；也可以构建双特异或多特异融合蛋白，产生新的功能和临床治疗效果；还具有穿透细胞膜进入细胞内，穿过血脑屏障，发挥大分子抗体不具有的功能。根据筛选靶点的不同，这些蛋白骨架分子，具有不同的功能，被用于开发治疗性药物或诊断检测试剂。(1，2)

美国Morphosys公司利用全人源合成抗体库筛选抗体(3)，进行广泛的药物开发，其中治疗牛皮癣的抗体药物Guselkumab已经进入了临床试验III期(4)。Ablynx公司基于羊驼抗体蛋白骨架开发的Caplacizumab，已进入III期临床，用于治疗血小板减少性紫癜(5)。另一个基于羊驼抗体蛋白骨架的抗体药物ALX-0061也进入了III期临床，用于治疗类风湿性关节炎(6)。Affibody公司开发的Affibody肿瘤显象剂ABY-025((her2))已经进入临床试验II期(7)。Molecular Partners公司开发的基因DARPin蛋白骨架开发的Abicipar进入临床试验III期，用于治疗年龄相关性黄斑变性(8)。

因此，寻找新的小分子蛋白骨架，并证明可以通过构建和筛选合成小分子蛋白骨架文库，获得特定功能分子，在药物开发过程中具有实用性。如果这种新型蛋白骨架具有全新的序列特征，就具有新颖性。

发明内容

本发明在于寻找一种新的鲨鱼抗体来源的蛋白骨架，构建通用蛋白骨架文库。

首先，获得中国南海产鲨鱼(点纹斑竹鲨，chiloscyllium punctatum)的脾脏，进行转录组测序，获得点纹斑竹鲨抗体序列库。通过序列分析，确定点纹斑竹鲨抗体的可变区。然后，将点纹斑竹鲨抗体可变区序列进行序列检索发现，有两种鲨鱼抗体序列与点纹斑竹鲨抗体序列的同源性在50％以上，分别为护士鲨(62％，The Nurse Shark，Ginglymostoma cirratum)和斑纹虎须鲨(61％，The Spotted Wobbegong，Orectolobusmaculatus)。点纹斑竹鲨抗体序列与这两种鲨鱼抗体序列之间存在显著差异。至此，我们发现了一种具有全新序列的抗体(QRVEQTPTTTTKEAGESLTINCVLKGSSCALGSTYWYFTKKGATKKASLSTGGRYSDTKNTASKSFSLRISDLRVEDSGTYHCEAYMRATAGCTVWNSYIEGGGTILTVK，SEQ ID NO：3)，点纹斑竹鲨抗体。

分析点纹斑竹鲨抗体的可变区，发现包括两部份：内部不变区域【C区】和内部可变区域【M区】。点纹斑竹鲨抗体整个可变区一共有4个半胱氨酸，其中C区内存在3个半胱氨酸。M区中存在一个位置不固定的半胱氨酸。四个半胱氨酸形成两个二硫键，由于位置不固定的半胱氨酸位于内部可变区(M区)内，具有可变性，即通过可变的二硫键将M区锚定在固定C区骨架上，推测M区的序列多样性和二硫键位置的可变性平衡了M区结构的弹性和刚性，是一种更为合理的结构多样性。