[发明专利]生产胞磷胆碱的基因工程菌的构建与应用

说明书

本发明涉及生产胞磷胆碱的基因工程菌的构建与应用。通过基因重组技术在酵母工程菌中引入了外源的HNM1、CKI和CCT基因，获得可生产胞磷胆碱的酵母工程菌。所述酵母工程菌具有代谢背景低、异源表达能力强，可利用氯化胆碱或磷酸胆碱发酵生产胞磷胆碱等特征，为工业化生产胞磷胆碱提供了新思路。

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及生产胞磷胆碱的基因工程菌的构建与应用。

背景技术

胞苷二磷酸胆碱(Cytidine Diphosphate Choline，别名胞磷胆碱或CDPC)是卵磷脂生物合成的重要中间产物。卵磷脂是细胞膜的重要组成成分，它的代谢正常与否直接影响细胞的通透性、能量代谢以及蛋白质生物合成等许多生物学功能。胞磷胆碱是一种重要的核酸类药物，它是治疗脑病的首选药物。胞磷胆碱具有神经修复，神经保护，促进神经递质释放等作用，目前一直用于脑卒中、帕金森氏病、阿尔茨海默病和血管性痴呆等疾病的治疗。因此，胞磷胆碱是一种具有重要药用作用的化合物。

目前胞磷胆碱的生产方法主要有化学合成法和生物合成法。化学方法主要见于早期工业路线，但是此法使用多种工业有毒有机试剂，转化率低，不适于大规模的生产。日本协和发酵株式会社开发了双菌发酵法，利用大肠杆菌和产氨棒杆菌等基因工程菌发酵生产胞磷胆碱，但是发酵工艺较为复杂。目前工业上利用啤酒泥通过添加胞嘧啶核苷酸(CMP)和磷酸胆碱作为底物生产胞磷胆碱(酶转化法)，但是底物价格较为昂贵，且酿酒酵母的发酵密度较低，难以提高生产效率。

由于CDPC的广泛应用，其市场需求量正逐步扩大，有着极大的需求缺口。如何高效率、高质量、低成本的生产CDPC是急需解决的问题。因此，本领域还需要进一步地研究和开发胞磷胆碱的其它生产方法，以期简化生产工艺，降低生产成本。

发明内容

本发明的目的在于提供利用氯化胆碱或磷酸胆碱作为底物发酵生产胞磷胆碱的基因工程菌的构建与应用。

在本发明的第一方面，提供一种生产胞磷胆碱的方法，所述方法包括：

(1)提供酵母工程菌，所述酵母工程菌中转化有下组基因的表达盒：

HNM1(hyper-resistance to nitrogen mustard)；

CCT(磷酸胆碱二胞苷酰转移酶)或CKI(胆碱激酶，choline kinase)之一或两者；

(2)培养(1)的酵母工程菌，添加氯化胆碱或磷酸胆碱和CMP作为底物，从而生成胞磷胆碱产物。

在另一优选例中，所述酵母工程菌中转化有HNM1和CKI基因的表达盒，以CMP和氯化胆碱为底物。

在另一优选例中，所述酵母工程菌中转化有HNM1和CCT基因的表达盒，以CMP和磷酸胆碱为底物。

在另一优选例中，所述酵母工程菌中转化有HNM1，CCT和CKI基因的表达盒，以CMP和氯化胆碱为底物。

在一个优选例中，所述的CCT基因来源于毕赤酵母。

在另一优选例中，所述的CKI和HNM1来源于酿酒酵母BY4742。

在另一优选例中，所述的CCT基因具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，或其简并序列，或与SEQ ID NO:1序列有70％以上(较佳地80％以上；更佳地90％以上；更佳的93％以上；更佳地95％以上；更佳的97％以上)相同性的编码同功能蛋白的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的CKI基因具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，或其简并序列，或与SEQ ID NO:2序列有70％以上(较佳地80％以上；更佳地90％以上；更佳的93％以上；更佳地95％以上；更佳的97％以上)相同性的编码同功能蛋白的核苷酸序列。