[发明专利]NBS320型生物反应器固定床灌流培养制备RABV‑dG株狂犬病病毒液的方法在审
申请号: | 201711181380.3 | 申请日: | 2017-11-23 |
公开(公告)号: | CN107937355A | 公开(公告)日: | 2018-04-20 |
发明(设计)人: | 夏振强;金宏丽;殷玉和;石晶;赵健;刘冰;陈宪平;刘伟;夏晓红 | 申请(专利权)人: | 长春西诺生物科技有限公司 |
主分类号: | C12N7/00 | 分类号: | C12N7/00;C12N7/02;C12M3/04;C12M1/04 |
代理公司: | 北京路浩知识产权代理有限公司11002 | 代理人: | 王文君,陈征 |
地址: | 130012*** | 国省代码: | 吉林;22 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | nbs320 生物反应器 固定床 灌流 培养 制备 rabv dg 狂犬病 毒液 方法 | ||
1.一种应用NBS320型生物反应器固定床灌流培养技术培养Vero细胞制备高滴度RABV-dG株狂犬病病毒液的方法,通过对溶氧、pH值、温度、转速、气流量参数的调整组合获得高密度状态良好的Vero细胞,以一定的比例接种RABV-dG株狂犬病病毒,然后通过对溶氧、pH值、温度、转速、气流量参数的组合调整获得高滴度RABV-dG株狂犬病病毒液,其特征在于,包括以下步骤:
a)用添加有4mM L-谷氨酰胺、体积比5%~10%新生牛血清、pH值被调节为7.2-7.4的VP-SFM培养基培养Vero细胞;
b)使用NBS320型生物反应器,在罐体固定床提篮内添加片状载体,连接常规进液、补液、补碱、废液等管道,连同细胞接种瓶、补液瓶、碱液瓶及废液瓶,对上述进行常规高压蒸汽灭菌后将各管道对应无菌连接,接上O2、N2、Air、CO2气体软管;
c)将步骤a)中培养的Vero细胞经消化后接种至步骤b)中的生物反应器中,接种量为5.0×108个/L-9.0×108个/L培养液,设置并控制溶氧、pH值、温度、转速、气流量参数,进行细胞培养;
d)细胞接种10-20h后,开始使用添加有4mM L-谷氨酰胺、体积比5%~10%新生牛血清、pH值被调节为7.2-7.4的VP-SFM培养基灌流培养,灌流量每天提高,依次为半个工作体积、一个工作体积、一个工作体积、两个工作体积,反应器内培养体积恒定;灌流量是指进液量=出液量;
e)细胞接种后3-4天,按0.05±0.02MOI加入RABV-dG株狂犬病病毒,调整溶氧、pH值、温度、转速、气流量参数,吸附6-12小时后开始灌流培养,灌流液为添加有4mM L-谷氨酰胺、pH值被调节为7.2-7.4的VP-SFM培养基,灌流量为每天一个工作体积;
f)病毒接种64±8小时后开始收获病毒液,每天收获一个工作体积,连续收获14-20天;
g)对每天收获的病毒液进行滴度检测。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤c)中培养的反应器参数设置为溶氧60±2%、pH值7.1±0.1、温度37±0.2℃、转速85±5rpm、气流量0.1L/min。
3.根据权利要求1-2任一项所述的方法,其特征在于,步骤e)中接种病毒后的反应器参数设置变更为为溶氧50±1%、pH值7.4±0.02、温度34±0.2℃、转速95±5rpm、气流量0.1±0.05L/min。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法,其特征在于,步骤e)中加入的狂犬病病毒为RABV-dG株狂犬病病毒,该病毒是反向遗传技术构建拯救,是首次采用生物反应器培养。
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