[发明专利]一种针对多环芳烃特异性降解的试剂的制备方法

说明书

本发明公开了一种针对多环芳烃特异性降解的试剂的制备方法，包括：二甲基异咯嗪的合成、二甲基异咯嗪的一次纯化、二甲基异咯嗪的二次纯化、小球藻蛋白液的提取、蛋白液的纯化、试剂的复配，所述试剂以光色素二甲基异咯嗪为探针，以小球藻蛋白酶液为引物复合，添加稳定剂制备而成。有益效果为：以光色素二甲基异咯嗪为多环芳烃检测探针，可高效定位多环芳烃，提高针对多环芳烃特异性降解的效率，同时试剂释放的小球藻蛋白液可有效针对多环芳烃的苯环结构进行断裂，将多环芳烃降解为醛、醇等物质，从而针对性的对其完成降解消除。

技术领域

本发明涉及环境工程材料技术领域，尤其是涉及一种针对多环芳烃特异性降解的试剂的制备方法。

技术背景

目前，海洋环境、土壤环境中一旦发生石油泄漏，会直接导致多环芳烃的富集，进而对生命体产生威胁。多环芳烃的激素作用可致癌、致畸、致突变，产生基因毒性，对人体的免疫系统造成破坏。因此，如何针对性地、高效地降解油类中所含的多环芳烃，阻隔人体摄入多环芳烃的渠道则显得尤为重要。

目前针对多环芳烃的处理方法主要有物理法（加热法、混凝沉淀法、吸附法），化学法（光氧化法、化学药剂氧化法），微生物法。鉴于物理、化学方法处理多环芳烃，去除不彻底的同时对环境还造成化学残余的隐患，目前研究着力于微生物法。已发表的微生物处理多环芳烃的相关资料表明，由于多环芳烃具有复杂的结构，故其降解率普遍不高，且已相关微生物在针对多环芳烃的降解时也有一定的局限性，即多数情况下，一种微生物只能特定降解一种多环芳烃。

发明内容

本发明的目的在于提供一种针对多环芳烃特异性降解的试剂的制备方法，制备方法简单易行，安全环保，试剂具有多环芳烃导向性与特异降解性，同时兼具低毒、环保、稳定、作用条件温和、污染物降解彻底的优点，且对环境无二次污染。

本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：一种针对多环芳烃特异性降解的试剂的制备方法，包括二甲基异咯嗪的合成、二甲基异咯嗪的一次纯化、二甲基异咯嗪的二次纯化、小球藻蛋白液的提取、蛋白液的纯化、试剂的复配，具体包括以下步骤：

二甲基异咯嗪的合成：将1.0-1.2g干燥的6，7二甲基-9-甲酸基甲基异咯嗪（FMF）固体置于烧杯内,加入30-32mL 0.10-0.12M的硼酸溶液和130-135mL 0.1-0.12M的氢氧化钠溶液，避光搅拌反应90-100分钟得二甲基异咯嗪，反应原理如图1；在避光、碱性条件下，将FMF脱去乙醛基制备得到二甲基异咯嗪，制备方法较为温和，反应过程易控，工艺简单；

二甲基异咯嗪的一次纯化：过滤反应液，将滤液置于分液漏斗中，加入二氯甲烷萃取,反复萃取直至萃取液为无色；在38-40℃温度下用旋转蒸发仪对萃取液旋转蒸发进行浓缩，浓缩液终体积为18-20mL；选用二氯甲烷作为萃取剂，毒性相对较低，萃取效果较好，为进一步的纯化做准备；

二甲基异咯嗪的二次纯化：对浓缩液做薄层层析分离，薄层厚度为0.18-0.25mm，通过凝胶成像仪观察荧光，再用柱层析分离浓缩液，柱层析的固定相为硅胶，流动相为重量比为6-8:3-5:1的正丁醇、甲醇、蒸馏水，层析后得到二甲基异咯嗪的溶液；将溶液在70-74℃旋转蒸发，得到浓缩液，再置于真空干燥箱内以55-58℃干燥得到浅黄色二甲基异咯嗪固体；薄层层析适用于微量、挥发性较小、不耐温的物质分离，根据二甲基异咯嗪与杂质在固定相和流动相中分配系数不同进行柱层析分离，经过两次分离纯化后二甲基异咯嗪的含量得到大大的提高；

小球藻蛋白液的提取：将小球藻在2-4℃、6000-8000r/min条件下离心浓缩8-10分钟，将浓缩液于超声破碎仪中进行细胞破壁，细胞破碎仪功率为1.0-1.2kW，探头振幅为35-38%，破碎时间为30-45分钟，破碎后所得液体置于2-4℃、10000-13000r/min条件下离心15-20分钟，取上清即为粗蛋白液；选用超声破碎仪破碎小球藻，其破壁效果较好，不会对活性物质造成影响，不会添加新的污染物质，有利于小球藻蛋白的提取与纯化；