[发明专利]一种利用免疫磁捕获快速检测阪崎克罗诺杆菌的方法

权利要求书

1.一种利用免疫磁捕获快速检测阪崎克罗诺杆菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)羧基磁珠的活化：将羧基磁珠与EDC溶液混合，获得活化的羧基磁珠；

(2)抗体的偶联：将活化的的羧基磁珠与阪崎克罗诺杆菌的单克隆抗体溶液混合进行共价偶联，获得免疫磁珠；

(3)菌体的捕获：将获得的免疫磁珠置于捕获体系中进行捕获；

(4)利用试剂盒法提取细菌基因组DNA，得到提取物；

(5)以提取物作为模板进行LAMP扩增，得到LAMP扩增产物；所述LAMP扩增反应的引物组如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示；

(6)取LAMP扩增产物，点样于质量浓度为2％的琼脂糖凝胶中，以100V电压在1×TAE电泳缓冲液中电泳30min，然后在凝胶成像系统中成像，即完成检测，若产生LAMP特异性扩增条带，表明该待检物中含有阪崎克罗诺杆菌，若无LAMP特异性扩增条带，表明该待检物中不含有阪崎克罗诺杆菌。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)是将羧基磁珠与MES溶液混合，磁分离后静置，弃上清，重悬于MES溶液中，200w超声10min后磁分离，弃上清，洗涤后重悬于MES溶液中，然后再按照羧基磁珠与EDC溶液的质量比为5:2.5～5:7.5进行活化，室温下振荡后获得活化的羧基磁珠。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)是将活化的羧基磁珠磁分离后重悬于MEST溶液中，按照羧基磁珠与阪崎克罗诺杆菌的单克隆抗体溶液的质量比为1:1～5:2进行共价偶联，室温下振荡过夜，然后用PBST溶液洗涤后重悬于PBS溶液中，获得免疫磁珠；所述MEST溶液为含有0.02％v/v Tween-20的MES溶液且pH为6.5。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)是向每400μL的捕获体系加入50μL～100μL免疫磁珠，捕获60min；所述捕获体系为阪崎克罗诺杆菌纯培养物或乳制品。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中LAMP扩增的反应体系为25μL，由下列成分组成：外引物与内引物的浓度比为1:4～1:9，LF引物0.6μM，LB引物0.6μM，10×Buffer 2μL，dNTPs 0.4μM～2.4μM，MgSO₄ 0μM～6μM，8U Bst2.0DNA酶1μL，模板DNA2μL，加入ddH₂0至25μL。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)所述LAMP扩增的反应条件为：64℃1h，80℃2min终止反应。