[发明专利]重组疫苗及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术药物技术领域，尤其涉及重组疫苗及其应用。

背景技术

癌症或恶性肿瘤是威胁人类健康的杀手，肿瘤的诱发原因错综复杂，我们至今缺乏对其具体形成机制的深刻理解。最近的研究表明，机体免疫系统与肿瘤细胞间存在循环相互作用，即免疫系统能够识别“非我”成分的癌细胞，癌细胞也能通过多种途径逃避机体免疫系统的监控和攻击，造成患者体内肿瘤细胞的扩散转移。肿瘤免疫逃逸的分子机制包括：肿瘤抗原表达下调或丢失，肿瘤细胞分泌具有免疫抑制功能的可溶性细胞因子，肿瘤微环境招募免疫抑制性淋巴细胞，以及肿瘤细胞上调表达负性协同刺激信号等。其中，在肿瘤局部微环境及干扰素γ等细胞因子的诱导下，活化的T细胞上大量表达负性共刺激分子，这些免疫抑制调控分子将直接影响效应细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的抗肿瘤活性，使其杀伤功能减弱甚至丧失。目前发现的抑制性协同刺激分子主要有CTLA4/CD80(CD86)、PD1/PD-L1(PD-L2)、BTLA/HVEM、TIM3/GAL9等。

人程序性细胞死亡蛋白1(Programmed Death-1,PD-1)又名CD279，它与两个配体PD-L1(B7H1,CD274)和PD-L2(B7DC,CD273)同属免疫球蛋白超家族I型跨膜糖蛋白，由胞浆区、跨膜锚定区和胞外位点结合域三部分构成。介导PD-1信号免疫抑制功能的关键结构，是位于胞内信号转导区的免疫受体酪氨酸转换基序(Immunoreceptortyrosine-based switch motif，ITSM)，当配受体偶联时，ITSM基序启动酪氨酸磷酸化程序以招募相关磷酸酶，使下游的信号通路PI3K/AKT(磷脂酰肌醇3激酶/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶)去磷酸化，从而导致细胞因子合成的中断和T细胞效应不敏感等。PD-1/PD-L1信号通路在正常组织器官及外周淋巴组织低表达或诱导性表达，对维持机体免疫耐受、防止自身免疫病的发生具重要意义；而肿瘤部位PD-1分子的高表达，则加速了活化T细胞的凋亡。

2013年，科学杂志授予免疫检查点阻断疗法年度重大科学突破，免疫治疗也真正使人们看到治愈癌症的希望。免疫检查点阻断疗法(Immune Checkpoint Blockade)即应用抑制剂阻断负性调节T细胞的共抑制信号通路，解除T细胞抑制并重新释放其免疫活性。当前开发的抑制剂主要是人源化单克隆抗体，分别阻断两个重要的免疫检查点——细胞毒性T淋巴细胞蛋白4(CTLA4)和PD-1。2014年，Herbst等报导一种能有效阻断PD-1配体PD-L1的单抗药物PMDL3280A治疗65例化药治疗无效的膀胱癌患者，结果30例PD-L1阳性患者中有13例(43％)产生明显的抑瘤肿瘤的效应，其中2人达到病情完全缓解；另外，在PD-L1阴性患者中也有11％的应答率。由此，体现出检查点阻断药物的抗肿瘤免疫应答优势，为癌症免疫治疗提供了新的研究思路。与此同时，单抗类抑制剂也存在一些弊端使得药物临床应用受到限制。例如，部分患者的肿瘤组织免疫组化检测显示没有T淋巴细胞浸润现象，可能导致此部分患者单抗治疗无效；也有一些患者在接受抗CTLA4抗体治疗后，出现致命的自身免疫病相关的不良反应；此外，人源化单克隆抗体制作成本较高，用药费用昂贵。这些问题都说明检查点阻断治疗需建立更加完善的适应症治疗者筛选程序和治疗方案，而目前开发的PD-1抗体形式阻断剂则无法引导抗肿瘤主动免疫，其阻断剂形式尚待进一步优化。文献资料显示，一种可溶型PD-1(sPD-1)蛋白可与配体PD-L1识别并结合，可作为另一PD-1/PD-L1信号通路阻断剂的形式应用于抗肿瘤免疫。

(1)可溶性PD-1分子的生物学特性

共刺激蛋白通常存在两种形式：锚定于细胞膜上或分泌到胞外，可溶型分子保留了膜型分子的胞外配受体结合域，以游离方式通过血液循环作用于远端效应分子，参与调节机体免疫。现已证实，天然的人PD-1分子包含上述两种蛋白形式，且膜型与可溶型PD-1(Soluble PD-1，sPD1)皆由PDCD1基因编码，其中，所编码的全长mRNA翻译产物为膜型分子，而一种缺失外显子3的mRNA剪接变异体则直接翻译成sPD1。sPD1形成的另一种方式，可能是膜型PD-1在蛋白水解酶作用下脱落产生。sPD-1的IgV-IgC样结构，介导与配体PD-L1和PD-L2的结合，但由于缺乏胞内抑制基序，无法启动下游免疫抑制信号。Wan等检测类风湿性关节炎患者的关节滑液及外周血中都有sPD1分子的高表达，同时伴随IFN-γ、IL-4、IL-21等T细胞活化相关细胞因子水平升高。