[发明专利]一种基于OUR为控制参数的葡萄糖氧化酶发酵方法

说明书

本发明公开了一种基于OUR为控制参数的葡萄糖氧化酶发酵方法，包括重组毕赤酵母的富集、发酵罐配料灭菌、接种、建立OUR反馈调控发酵机制、离心、冷冻干燥等过程。本发明可以通过OUR的变化，有效监测毕赤酵母在发酵过程中甲醇含量的变化，从而更方便、快捷、准确地判断毕赤酵母所需碳源和能源的变化，提高葡萄糖氧化酶的质量，降低经济损失。

技术领域

本发明涉及发酵工程技术领域，更具体地说是涉及一种基于OUR为控制参数的葡萄糖氧化酶发酵方法

背景技术

葡萄糖氧化酶(简称GOD)是一种需氧脱氢酶，通常与过氧化氢酶联合发挥催化作用。有氧条件下，GOD能够专一性地催化氧化β-D葡萄糖生成葡萄糖酸内酯和过氧化氢，其中过氧化氢在过氧化氢酶的作用下分解生成水，葡萄糖酸内酯随后自发水解或在内酯酶的作用下水解成葡萄糖酸。GOD因其具有的氧化还原性，在食品、饲料、医药、生物等行业被广泛应用，具有广阔的应用前景。

现有技术中，葡萄糖氧化酶的大规模生产主要来自GOD基因的外源表达。巴斯德毕赤酵母作为一种成熟的外源蛋白表达系统，在无其它碳源存在的条件下，能以甲醇为唯一碳源生长产酶，并且受甲醇唯一调控，具有生长迅速、营养条件需求低、蛋白表达量高、副产物少等优点。但是毕赤酵母发酵过程属于高好氧发酵，当发酵液在高耗氧条件下，传统的溶氧电极度数几乎接近零点。在传统的甲醇诱导型毕赤酵母的发酵工艺中，甲醇补料速度是非常关键的，作为诱导过程中唯一的碳源和能源，甲醇的补料方式、浓度、诱导时间对外源蛋白的表达都会产生影响。在诱导阶段，除了要防止其浓度过高对细胞产生毒害作用，还要保证甲醇浓度能够提供毕赤酵母表达代谢所必需的碳源和能源，避免因过低浓度导致细胞持续饥饿，造成生物量和表达量都下降。然而甲醇过量与甲醇补料不足的表现十分相似，经验不足的情况下往往会判断错误，造成无可挽救的损失。

因此，如何提供一种能够正确反应毕赤酵母发酵用营养物质变化的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种基于OUR为控制参数的葡萄糖氧化酶发酵方法。此种方法可以有效监测毕赤酵母发酵过程中营养物质的变化，从而减少不必要的经济损失。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种基于OUR为控制参数的葡萄糖氧化酶发酵方法，葡萄糖氧化酶发酵用菌种为将葡萄糖氧化酶基因转入野生型毕赤酵母体内得到的重组毕赤酵母，包括以下步骤：

1)菌种的富集培养：将重组的毕赤酵母依次接种于一级培养基和二级培养基中，进行菌种的富集；

2)将步骤1)所得发酵液置于灭菌后的发酵罐营养液中；

3)建立OUR反馈调控发酵机制，包括：

(1)批发酵：将步骤1)中的菌种接入步骤2)的发酵罐中，进行发酵。初始发酵时，通过控制种子浓度及搅拌转速和风量控制毕赤酵母耗氧速率为0.4-0.7molO2/L/h；经过3-4h的适应期后，毕赤酵母开始呈指数生长，OUR值随之缓慢呈平滑抛物线形式上升至35-45molO2/L/h，至发酵罐中甘油完全耗尽，此时OUR值下降为18-24molO2/L/h，得到初始发酵液。批发酵时间为18-23h；

(2)甘油补料：向步骤(1)所得初始发酵液中流加50％甘油和1.2％的PTM1的混合液体，初始流加速率控制在18-19ml/L/h，使OUR值以平滑的抛物线上升至115-125molO2/L/h，至OD600＝300-400时，停止补料，此时OUR值为45-62molO2/L/h，得到二次发酵液；