[发明专利]利用双荧光素酶报告基因检测鸭IFN-β启动子活性的方法有效
| 申请号： | 201711195597.X | 申请日： | 2017-11-24 |
| 公开（公告）号： | CN108004270B | 公开（公告）日： | 2021-06-18 |
| 发明（设计）人： | 孙建和;刘云霞;程玉强;严亚贤 | 申请（专利权）人： | 上海交通大学 |
| 主分类号： | C12N15/85 | 分类号： | C12N15/85;C12N15/66;C12Q1/66 |
| 代理公司： | 上海汉声知识产权代理有限公司 31236 | 代理人： | 庄文莉 |
| 地址： | 200240 *** | 国省代码： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 利用 荧光 报告 基因 检测 ifn 启动子 活性 方法 | ||
1.一种利用双荧光素酶报告基因检测鸭IFN-β启动子活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、构建含鸭IFN-β启动子靶序列的萤火虫荧光素酶重组质粒；
B、将含鸭IFN-β启动子靶序列的萤火虫荧光素酶重组质粒与刺激物、内参质粒及脂质体预混后转染鸭胚成纤维细胞DEF，所述内参质粒为海参荧光素酶质粒；
C、将转染后的DEF细胞进行培养后裂解，检测荧光素酶活性，即得鸭IFN-β启动子活性；
步骤A的构建方法包括以下步骤：将鸭IFN-β启动子靶序列连接至萤火虫荧光素酶报告质粒上；
所述鸭IFN-β启动子靶序列为鸭IFN-β启动子区域-324位至第一外显子+63位形成的片段序列；
所述鸭IFN-β基因启动子序列的GenBank登录号为KM032183.1；
获得所述鸭IFN-β启动子靶序列采用的上游引物的序列如SEQ ID No.2所示；下游引物的序列如SEQ ID No.3所示。
2.根据权利要求1所述的利用双荧光素酶报告基因检测鸭IFN-β启动子活性的方法，其特征在于，获得所述鸭IFN-β启动子靶序列采用的PCR扩增的反应条件为：变性 98℃ 10s、退火 58℃ 15s、延伸 68℃ 1min，30个循环，终延伸 68℃ 5min。
3.根据权利要求1所述的利用双荧光素酶报告基因检测鸭IFN-β启动子活性的方法，其特征在于，步骤B中，所述刺激物包括RIG-I、poly(I:C) 或dsDNA中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的利用双荧光素酶报告基因检测鸭IFN-β启动子活性的方法，其特征在于，步骤B中，所述转染细胞采用的脂质体的转染量为1μL/孔。
5.根据权利要求1所述的利用双荧光素酶报告基因检测鸭IFN-β启动子活性的方法，其特征在于，步骤C中，所述培养时间为20小时。
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