[发明专利]一种敲除PD1的靶向CD20的嵌合抗原受体T细胞及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种敲除PD1的靶向CD20的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，包括：将靶向CD20的嵌合抗原受体CAR‑CD20的编码基因与载体相连，进行重组慢病毒的构建，并转染CD3阳性T淋巴细胞，将转染后的T细胞的PD1基因进行敲除，得到敲除PD1的靶向CD20的嵌合抗原受体T细胞。所述T细胞敲除了PD1基因，有利于T细胞在患者体内的扩增，避免肿瘤细胞逃脱免疫监视，具有高效且特异性地杀伤CD20阳性肿瘤细胞的性能，持久地维持细胞的活力和杀伤力。

技术领域

本发明涉及医学生物领域，特别涉及一种敲除PD1的靶向CD20的嵌合抗原受体T细胞及其制备方法和应用。

背景技术

CAR-T(嵌合抗原受体T细胞)技术是一种新型细胞疗法，它是将经过CA R改造的T细胞回输至人体，激活自身免疫系统，对肿瘤细胞进行杀伤，在急性白血病和非霍奇金淋巴瘤的治疗上有着显著的疗效，被认为是目前最有效的恶性肿瘤的治疗方式之一。

目前CAR-T技术在CD19阳性血液瘤(如B细胞淋巴瘤、急慢性B淋巴细胞白血病)中取得了令人瞩目的效果。但由于同类的肿瘤常表达各不相同的免疫表型，举例来说，当肿瘤细胞出现CD19阴性逃逸，即，存在不表达CD19的肿瘤细胞，则CD19靶点失效，而CART-CD19无法再发挥抗肿瘤效果。

程序性死亡蛋白(PD1)是免疫检查点抑制(immune checkpoint inhibition)中的代表性分子，在机体免疫中通过阻止T细胞激活来负向调节免疫反应，以防止自身免疫疾病并保证自体耐受。在肿瘤微环境中，PD1会抑制杀伤性T细胞的活性，从而使肿瘤细胞逃脱免疫监视。因此，有必要提供能靶向恶性肿瘤的其他广泛表达靶点的CAR-T细胞且可避免肿瘤细胞逃脱免疫监视。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种敲除PD1的靶向CD20的嵌合抗原受体T细胞，所述靶向CD20嵌合抗原受体T细胞敲除了PD1基因，有利于T细胞在患者体内的扩增，避免肿瘤细胞逃脱免疫监视，具有高效且特异性的杀伤肿瘤细胞的性能，持久地维持细胞的活力和杀伤力。

第一方面，本发明提供了一种敲除PD1的靶向CD20的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，包括：

(1)提供靶向CD20的嵌合抗原受体CAR-CD20的编码基因，包括从5’端到3’端顺次连接的信号肽的编码基因、靶向CD20的单链抗体的编码基因、胞外铰链区的编码基因、跨膜区的编码基因、胞内信号区的编码基因，其中，所述靶向CD20的单链抗体的编码基因包括编码如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的核苷酸序列；

(2)将所述CAR-CD20的编码基因插入到pWPXLD载体中，得到pWPX LD-CAR-CD20重组质粒；

(3)包装所述pWPXLD-CAR-CD20重组质粒，得到重组慢病毒；

(4)将所述重组慢病毒转染CD3阳性T淋巴细胞，获得嵌合抗原受体T细胞；

(5)敲除所述嵌合抗原受体T细胞的PD1基因，获得敲除PD1的靶向CD20的嵌合抗原受体T细胞。

可选的，所述靶向CD20的单链抗体的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

可选的，所述靶向CD20的单链抗体的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ I D NO：5所示的核苷酸序列。

可选的，所述靶向CD20的单链抗体的氨基酸序列的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQ ID NO:5具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:1。