[发明专利]一种敲除PD1的靶向CD317的嵌合抗原受体T细胞及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种敲除PD1的靶向的CD317嵌合抗原受体T细胞的制备方法，包括：将靶向CD317的嵌合抗原受体CAR‑CD317的编码基因与载体相连，进行重组慢病毒的构建，并转染CD3阳性T淋巴细胞，将转染后的T细胞的PD1基因进行敲除，得到敲除PD1的靶向CD317的嵌合抗原受体T细胞。所述靶向CD317嵌合抗原受体T细胞敲除了PD1基因，有利于T细胞在患者体内的扩增，避免肿瘤细胞逃脱免疫监视，可以高效且特异性地杀伤CD317阳性肿瘤细胞，持久地维持活力和杀伤力，并且对正常细胞不会造成损伤。

技术领域

本发明涉及医学生物领域，特别涉及一种敲除PD1的靶向CD317的嵌合抗原受体T细胞及其制备方法和应用。

背景技术

恶性肿瘤(癌症)已成为威胁人类生命的元凶，发病率成上升趋势。CD317是脂筏相关蛋白，主要表达在肝癌、结肠癌等多种实体瘤细胞上，而在普通细胞中几乎很少表达。CD317的表达往往是细胞对gamma-干扰素通路的应答表现，因此与肿瘤的发生有密切关系。

CAR-T(嵌合抗原受体T细胞)技术是一种新型细胞疗法，它是将经过CAR改造的T细胞回输至人体，激活自身免疫系统，对肿瘤细胞进行杀伤，被认为是目前最有效的恶性肿瘤的治疗方式之一。但目前CAR-T技术的应用还局限于血液瘤，对肝癌等多种实体瘤还未有进展。

程序性死亡蛋白(PD1)是免疫检查点抑制(immune checkpoint inhibition)中的代表性分子，在机体免疫中通过阻止T细胞激活来负向调节免疫反应，以防止自身免疫疾病并保证自体耐受。在肿瘤微环境中，PD1会抑制杀伤性T细胞的活性，从而使肿瘤细胞逃脱免疫监视。目前还未有敲除PD1的靶向CD317的嵌合抗原受体T细胞且可避免肿瘤细胞逃脱免疫监视的研究。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种敲除PD1的靶向CD317的嵌合抗原受体T细胞，所述敲除PD1的靶向CD317的嵌合抗原受体T细胞敲除了PD1基因，有利于T细胞在患者体内的扩增，避免肿瘤细胞逃脱免疫监视，具有高效且特异性的杀伤CD317阳性肿瘤细胞的性能，更好的维持细胞的活力和杀伤力，并且对正常细胞不会造成损伤。

第一方面，本发明提供了一种敲除PD1的靶向CD317的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，包括：

(1)提供靶向CD317的嵌合抗原受体CAR-CD317的编码基因，包括从5’端到3’端顺次连接的信号肽的编码基因、靶向CD317的单链抗体的编码基因、胞外铰链区的编码基因、跨膜区的编码基因、胞内信号区的编码基因，其中，所述靶向CD317的单链抗体的编码基因包括编码如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的核苷酸序列；

(2)将所述CAR-CD317的编码基因插入到pWPXLD载体中，得到pWPXLD-CAR-CD317重组质粒；

(3)包装所述pWPXLD-CAR-CD317重组质粒，得到重组慢病毒；

(4)将所述重组慢病毒转染CD3阳性T淋巴细胞，获得嵌合抗原受体T细胞；

(5)敲除所述嵌合抗原受体T细胞的PD1基因，获得敲除PD1的靶向CD317的嵌合抗原受体T细胞。

可选的，所述靶向CD317的单链抗体的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

可选的，所述靶向CD317的单链抗体的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。

可选的，所述靶向CD317的单链抗体的氨基酸序列的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQ ID NO:5具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:1。