[发明专利]一种TCR敲除的靶向MAGE-A3的T细胞受体基因修饰T细胞及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种TCR敲除的靶向MAGE-A3的T细胞受体基因修饰T细胞的制备方法，其特征在于，包括：

(1)提供CD3阳性T淋巴细胞，敲除所述CD3阳性T淋巴细胞的TCR基因，得到TCR敲除的CD3阳性T淋巴细胞；

(2)提供靶向MAGE-A3的T细胞受体TCR-MAGE-A3的编码基因，包括从5’端到3’端顺次连接的α链的编码基因、2A肽的编码基因和β链的编码基因，其中，所述α链的编码基因包括编码如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的核苷酸序列，所述β链的编码基因包括编码如SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列的核苷酸序列，所述2A肽的编码基因包括编码如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的核苷酸序列；

(3)将所述TCR-MAGE-A3的编码基因插入到pLenti载体中，得到pLenti-TCR-MAGE-A3重组质粒；

(4)包装所述pLenti-TCR-MAGE-A3重组质粒，得到重组慢病毒；

(5)将所述重组慢病毒转染所述TCR敲除的CD3阳性T淋巴细胞，得到TCR敲除的靶向MAGE-A3的T细胞受体基因修饰T细胞。

2.如权利要求1所述的TCR敲除的靶向MAGE-A3的T细胞受体基因修饰T细胞的制备方法，其特征在于，所述α链的编码基因包括如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。

3.如权利要求1所述的TCR敲除的靶向MAGE-A3的T细胞受体基因修饰T细胞的制备方法，其特征在于，所述β链的编码基因包括如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。

4.如权利要求1所述的TCR敲除的靶向MAGE-A3的T细胞受体基因修饰T细胞的制备方法，其特征在于，所述2A肽的编码基因包括如SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列。

5.如权利要求1所述的TCR敲除的靶向MAGE-A3的T细胞受体基因修饰T细胞的制备方法，其特征在于，所述敲除所述CD3阳性T淋巴细胞的TCR基因，包括：

将所述Cas9的编码基因插入至pcDNA3.1载体中，得到pcDNA3.1-cas9重组质粒，以所述pcDNA3.1-cas9重组质粒为模板进行体外转录得到Cas9mRNA；

提供靶向TCR基因的sgRNA对应的基因序列；将所述靶向TCR基因的sgRNA对应的基因序列插入至pcDNA3.1载体中，得到pcDNA3.1-TCR-sgRNA重组质粒，以所述pcDNA3.1-TCR-sgRNA重组质粒为模板进行体外转录得到sgRNA；

将所述Cas9mRNA和所述靶向TCR基因的sgRNA与所述CD3阳性T淋巴细胞进行混合，并置于电转仪中进行电转，完成所述CD3阳性T淋巴细胞的TCR基因的敲除。

6.如权利要求5所述的TCR敲除的靶向MAGE-A3的T细胞受体基因修饰T细胞的制备方法，其特征在于，所述靶向TCR基因的sgRNA对应的基因序列包括如SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列。

7.如权利要求5所述的TCR敲除的靶向MAGE-A3的T细胞受体基因修饰T细胞的制备方法，其特征在于，所述Cas9mRNA和所述TCR基因的sgRNA的质量比为1:1-1:5。

8.如权利要求1所述的TCR敲除的靶向MAGE-A3的T细胞受体基因修饰T细胞的制备方法，其特征在于，所述包装所述pLenti-TCR-MAGE-A3重组质粒，得到重组慢病毒包括：

将所述pLenti-TCR-MAGE-A3重组质粒与包膜质粒和包装质粒共同转染宿主细胞，得到所述重组慢病毒。