[发明专利]产抗厌氧菌化合物的菌株和发酵方法、抗厌氧菌化合物提取及制备方法和使用方法

权利要求书

1.一株产抗厌氧菌化合物的菌株，其为焦曲霉(Aspergillus ustus)A2，保藏编号为CCTCC NO.M 2017715。

2.权利要求1所述的产抗厌氧菌化合物的菌株在食品领域中的应用。

3.利用权利要求1所述的产抗厌氧菌化合物的菌株进行的发酵和产物富集方法，其特征是，所述方法包括以下步骤：

(a)将焦曲霉(Aspergillus ustus)A2在25℃，麦芽固体培养基活化培养7d后，取0.5cm²菌块接种到400mL麦芽液体培养基，在24℃恒温振荡箱中培养5d，得到该菌株液体种子液；

(b)将上述菌株液体种子液按8％接种量，接种到50g固体生产培养基，放置22℃恒温培养箱中培养25d，结束发酵，得到含有抗厌氧菌化合物的发酵产物；该菌株生产的抗厌氧菌化合物包括4个结构新型的补身烷类倍半萜化合物ustusol H1(焦曲霉素H1)，ustusol H2(焦曲霉素H2)，ustusol H3(焦曲霉素H3)，ustusol H4(焦曲霉素H4)和已知化合物TMC-120C(2-(7-甲基-2,3-二氢呋喃[3,2-h]异喹啉-2-yl)丙醇-2-醇)；

步骤(a)中，所述麦芽固体培养基的组成为：生麦芽20g、蛋白胨2g、羧甲基纤维素钠1g，K₂HPO₄ 1g、KCl 0.5g、MgSO₄ 0.5g、FeSO₄ 0.01g、酵母膏1g，琼脂粉20g，加水溶解至1000ml、分装、灭菌后备用；不加琼脂，其余组成与上述的麦芽固体培养基相同，以形成所述的麦芽液体培养基；

步骤(b)中，所述固体生产培养基的制备步骤为：生麦芽20g、大米20g、麸皮10g，玉米芯10g，维生素C 0.5g，混合均匀后，加入72毫升水浸泡4h，灭菌后为固体生产培养基。

4.一类抗厌氧菌化合物提取及制备方法，其特征是，所述方法包括以下步骤：

(a)将权利要求3中发酵产物按照质量体积比为1：8的比例加入甲醇，25℃超声震荡30min，抽滤得到提取液；上述提取液中加入石油醚以体积比1：1进行萃取，取甲醇部分在40℃下抽真空旋转蒸发得到含抗厌氧菌化合物的浸膏；

(b)将上述浸膏通过流动相，流动相为甲醇：水且含0.1％HF，在反向色谱柱上进行梯度洗脱；收集甲醇：水体积比60-65％段，旋转蒸发仪蒸干，通过HPLC制备得到ustusol H1，ustusolH2，ustusolH3和ustusol H4；收集甲醇：水体积比70％段，旋转蒸发仪蒸干，通过HPLC制备得到TMC-120C；

所述ustusol H1，ustusolH2，ustusolH3和ustusol H4 HPLC制备条件是：色谱柱Allsphere ODS-2.5μm、250×4.6mm，柱温30℃，流动相甲醇：水体积比60％，出峰时间分别为16.2min，18.2min，21.05min和25.5min；

所述TMC-120C HPLC制备条件是：色谱柱Allsphere ODS-2.5μm、250×4.6mm，柱温30℃，流动相甲醇：水体积比65％，出峰时间为7.5min。