[发明专利]一种PM2.5颗粒对人肺细胞内自由基代谢通路影响的评估方法

权利要求书

1.一种PM_2.5全化学组分颗粒对人肺细胞内自由基代谢通路影响的评估方法，其特征在于以下步骤：

(a)原代培养人肺上皮细胞接种于六孔板，接种密度为1×10⁵个/mL六孔板内每孔加入培养液体积为3mL；在培养箱培养24-48h(37℃，5％CO₂)，待细胞进入对数生长期覆盖培养板80％后；用PM_2.5全化学组分颗粒对人肺细胞进行暴露，即移弃原培养液，每孔加入PM_2.5全化学组分颗粒的培养液3mL，以保证细胞生长营养需求，在原条件下培养24小时后收取细胞；

(b)步骤a所得细胞样品提取细胞内小分子代谢产物；利用基于LC-MS的质谱方法对小分子代谢产物进行定量分析；

(c)步骤a所得细胞样品，经超声破碎制得悬液，测定与能量代谢相关酶的活性；

所述加入含PM_2.5全化学组分颗粒的培养液为1～4mL，优选3mL，浓度为10μg/mL-250μg/mL。

2.根据权利要求1所述的研究方法，其特征在于：步骤b)中提取细胞内小分子代谢产物的过程具体分为两步：

第一步，脂肪酸提取，移弃培养液，每孔加入1ml 18.2MΩ超纯水清洗，废液弃完全且无残留，每孔加满液氮淬灭细胞；待液氮挥发后，每孔加入0.5ml 18.2MΩ超纯水，超声破碎1～10min，优选5min，破碎后的悬液移出，尽量保证无细胞碎片残留，转移完全，，置于EP管中于-60～-30℃，优选-40℃冷冻干燥,冻干后加入10～20μL，优选20μL内标混合液(正亮氨酸浓度为200nmol/L，十一酸浓度为10mg/L，十九酸浓度为10mg/L，溶剂为乙腈)，涡旋混匀；加入400μL MTBE涡旋提取20min，加入260μL水涡旋5min混匀，12000rpm/min、4℃下离心20min，取上清氮气吹干，乙腈定容，LC-MS分析游离脂肪酸；

第二步，氨基酸，葡萄糖，乳酸的提取，脂肪酸提取后剩余部分依次加入100μL MTBE和130μL甲醇，涡旋震荡20min，12000rpm/min、4℃下离心20min，取下层直接用于串联四极杆复合线性离子阱质谱分析。

3.根据权利要求2所述的研究方法，其特征在于：在小分子代谢产物定量分析中，非极性组分游离脂肪酸的分离色谱柱为Ufavour C₈柱(waters,150mm×2.1mm,3.0μm)，流动相A为H₂O，B为含1-5mM乙酸铵的乙腈，C为乙腈；流动相梯度为(时间，B和C的体积百分数，流速)：0-5min,20％B,70％C,250μL/min；在1分钟内C由70％增加为80％；7-15min,20％B,80％C,250μL/min；16-20min,20％B,70％C,300μL/min；上述过程中流动相A与流动相B总流速始终为200μL/min，进样量为5μL；质谱扫描模式为ESI(-)MRM，整个分析过程在18min内完成。

4.根据权利要求1所述的研究方法，其特征在于：在小分子代谢产物定量分析中，极性组分包括氨基酸，葡萄糖和乳酸，其分离色谱柱为AtlantisC₁₈高效液相色谱柱(waters,150mm×2.1mm,3.0μm)；流动相A为含0.1-0.5％(体积百分比)甲酸的H₂O，流动相B为甲醇；流动相梯度为：0-2min，95％A and 5％B；然后在3min之内A减少为40％，B增加为60％，维持4min；在1分钟内A增加到95％，B减少为5％，维持8min；上述过程中流动相A与流动相B总流速始终为200μL/min，进样量为5μL；质谱扫描模式为ESI(+)MRM；整个分析过程在20min内完成。