[发明专利]一种panD突变基因、基因工程及其在催化生产β-丙氨酸中的应用

说明书

本发明公开了一种panD突变基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.3所示，所述的panD突变基因SEQ ID No.1是panD基因的第34位碱基由A变成G；所述的panD突变基因SEQ ID No.3是panD基因的第50位碱基由T变成C。本发明还公开了包含上述突变基因的基因工程以及该基因工程菌在催化生产β‑丙氨酸中的应用。本发明包含panD突变基因的基因工程菌可以高效转化L‑天冬氨酸来生物法制备β‑丙氨酸，β‑丙氨酸的产量分别达42.81g/L和19.46g/L左右，比亲株分别提高了近4.8倍和2.2倍。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种panD突变基因、基因工程及其在催化生产β-丙氨酸中的应用。

背景技术

β-丙氨酸，别名：3-氨基丙酸(3-aminopropanoic acid)，又称为β-氨基丙酸，β-丝析氨酸，β-初油氨基酸，作为一种重要的化学品，广泛应用于化妆品、水处理、建筑、饲料、食品、医药等多个领域。如：可以作为铅中毒解毒剂。β-丙氨酸又是一种潜在平台化合物，通过化学反应，可衍生出多种重要的化学品，如：D-泛酸钙、尼龙-3、丙烯腈等。目前全球D-泛酸钙年产量6000-7000t，年需求量达上万吨，产品供不应求。医药工业中β-丙氨酸主要作为初始原料合成泛酸钙、肌肽、帕米膦酸钠、巴柳氮、β-丙氨酸金属配合物。由于β-丙氨酸及其衍生物在美容、食品、医药、动植物饲料及化工等领域的广泛应用，市场需求量呈日渐上升趋势。

L-天冬氨酸α-脱羧酶(ACD)能催化脱去L-天冬氨酸的位羧基，产生β-丙氨酸和二氧化碳。上世纪七八十年代，Nakano、Williamson等研究团队先后发现大肠杆菌能利用细胞内PanD合成β-丙氨酸，并对该酶的作用机理进行了研究。然而天然PanD的活性比较低，且直接从自然界中获得产酶活力高的菌株比较困难。1999年，德国Dusch等人首次将谷氨酸棒杆菌来源的panD基因分别克隆到大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌中表达。专利CN 101210230A中将大肠杆菌中的L-天冬氨酸-α-丙氨酸脱羧酶基因克隆并进行异源表达，但是合成β-丙氨酸的能力只达到2.94g/L，离真正应用还有很大距离。

尽管panD基因的重组表达在一定程度上提高了其在生物法制备β-丙氨酸中的能力，但天然序列和结构的panD的重组表达量和活力目前还不够高，这限制了PanD在生物法制备β-丙氨酸中的应用。针对这个问题，国内外研究人员对panD基因进行了随机突变，以期研究panD序列与功能的关系，为提高panD的活力提供理论基础。Pei等以枯草的重组菌株为研究对象，采用随机突变的方式，得到的突变菌株的最高酶活是野生菌的50％。就目前而言β-丙氨酸合成的研究热点及难点：提高天冬氨酸脱羧酶的活性和产量。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种panD突变基因。

本发明还要解决的技术问题是提供一种具有较高天冬氨酸脱羧酶活性的基因工程菌。

本发明最后要解决的技术问题是提供利用上述基因工程菌全细胞催化生产β-丙氨酸的应用。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案如下：

一种panD突变基因，其核苷酸序列如SEQID No.1或SEQ ID No.3所示。

其中，所述的panD突变基因SEQID No.1是panD基因的第34位碱基由A变成G；所述的panD突变基因SEQID No.3是panD基因的第50位碱基由T变成C。

所述的panD基因来源于C.glutamicum(ATCC13032)中编码L-天冬氨酸-a-脱羧酶的panD基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

一种panD突变基因的编码蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.2或SEQ ID No.4所示。