[发明专利]一种鸽痘病毒PCR诊断试剂盒及其检测方法

说明书

本发明提供了一种鸽痘病毒PCR诊断试剂盒，包括裂解液、扩增反应混合液、阴性对照和阳性对照；其中，所述裂解液的成分为DNAiso Reagent；所述扩增反应混合液包含灭菌三蒸水、PCR Buffer、dNTP、POX‑F上游引物、POX‑R下游引物和rTaq DNA聚合酶；所述阴性对照为灭菌三蒸水；所述阳性对照为鸽痘病毒阳性质粒。本发明的鸽痘病毒PCR诊断试剂盒灵敏度高、特异性好、稳定性高、结果直观，其检测方法易于操作、方便快捷，能大幅缩短检测时间，为临床控制鸽痘病毒感染提供有力的技术手段。

技术领域

本发明涉及动物医学动物疫病分子生物学诊断领域，具体涉及一种鸽痘病毒PCR诊断试剂盒及其检测方法。

背景技术

鸽痘(Pigeonpox，POX)是由鸽痘病毒引起的鸽的病毒性传染病。临床分为皮肤型和黏膜型，本病毒主要通过皮肤或粘膜的伤口侵入体内，传染媒介是某些吸血昆虫尤其是蚊子。其特征是体表无羽毛部位皮肤出现散在的、结节状的痘疹(皮肤型)，或上呼吸道、嚎角、口腔、咽喉和食道茹膜出现形成一层黄白色干酪样伪膜(黏膜型)，因而影响运动、吞咽、呼吸，极易造成患病鸽因饥饿或窒息而死亡。

PCR技术在动物疫病快速诊断中得到了广泛应用，目前尚未有诊断鸽痘病毒的PCR诊断试剂盒，临床上无法快速诊断出鸽痘病毒，检测周期长、成本高。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种鸽痘病毒PCR诊断试剂盒及其检测方法，该试剂盒灵敏度高、特异性好、稳定性高、结果直观，其检测方法易于操作、方便快捷，能大幅缩短检测时间，为临床控制鸽痘病毒感染提供有力的技术手段。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现。

(一)一种鸽痘病毒PCR诊断试剂盒，包括裂解液、扩增反应混合液、阴性对照和阳性对照；其中，所述裂解液的成分为DNAiso Reagent；所述扩增反应混合液包含灭菌三蒸水、PCR Buffer、dNTP、POX-F上游引物、POX-R下游引物和rTaq DNA聚合酶；所述阴性对照为灭菌三蒸水；所述阳性对照为鸽痘病毒阳性质粒。

优选的，所述POX-F上游引物的序列为：5’-GACTCTAGTCTACACCACT GCCT-3’；所述POX-R下游引物的序列为：5’-AAAATAATGGAACTACATAGT A-3’。

优选的，所述裂解液的成分为DNAiso Reagent，20个反应共计20mL，装成1瓶；所述扩增反应混合液包含灭菌三蒸水、10×PCR Buffer、2.5mmol·L-1dNTP、25μmol·L-1POX-F上游引物、25μmol·L-1POX-R下游引物和5U/μL rTaq DNA聚合酶，每个反应体积比为17.0︰2.5︰2︰0.5︰0.5︰0.5，共计23μL，20个反应共计460μL，装成1管；所述阴性对照为灭菌三蒸水，20个反应共计2.0mL，装成1瓶；所述阳性对照为鸽痘病毒阳性质粒，20个反应共计40.0μL，装成1管。

(二)一种鸽痘病毒PCR诊断试剂盒的检测方法，包括以下检测步骤：

步骤1，DNA提取

子步骤1.1，待检样品DNA提取：吸取待检样品置入无菌离心管(EP管)，加入裂解液，颠倒混匀，静置裂解，加入无水乙醇，颠倒混匀，静置沉淀，离心，弃去上清液，洗涤，弃去洗涤液，倒置无菌离心管，在空气中自然干燥，用NaOH溶解，得待检样品DNA提取液；

子步骤1.2，阴性对照样品提取：吸取灭菌三蒸水置入无菌离心管，加入裂解液，颠倒混匀，静置裂解，加入无水乙醇，颠倒混匀，静置沉淀，离心，弃去上清液，洗涤，弃去洗涤液，倒置无菌离心管，在空气中自然干燥，用NaOH溶解，得阴性对照样品提取液；