[发明专利]一种提高天然混合菌源NADH途径产氢量的方法

说明书

本发明公开了一种提高天然混合菌源NADH途径产氢量的方法，第一步，采用堆沤成熟的牛粪堆肥作为天然混合菌源，进行富集培养，制得种子液；第二步，以种子液作为接种物，NAD⁺合成前体作为生长因子，加入常规暗发酵产氢培养基，进行发酵产氢。本发明以NAD⁺合成前体烟酰胺、烟碱、烟酸为生长因子，通过影响天然混合菌源暗发酵NADH产氢途径，能够显著提高产氢量，并大幅降低发酵废液中各种挥发性脂肪酸、醇的浓度，降低了发酵废液后续处理的难度，是NADH产氢途径的创新，为低成本、简单可行的产氢方法提供了新的途径，为生物制氢提供了新的研究方向，具有良好的社会和经济效益。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及提高微生物产氢量的方法，尤其是涉及一种提高天然混合菌源NADH途径产氢量的方法。

背景技术

随着我国工业的迅速发展，各行业对资源的需求日益增加。目前所利用的能源主要是煤炭、石油、天然气等化石资源，但它们的储量有限。尤其是石油资源，据国家统计局官网的数据显示：2016年中国原油进口量为3.76亿吨，对外依存度达到65.5％。国际能源署预测：到2030年我国石油对外依存度将达到80％。另一方面，化石资源的大量开采和使用，造成一系列环境问题，如酸雨、臭氧层空洞、温室效应、大范围持久的雾霾天气等。因此开发清洁、高效的可再生能源势在必行。

众所周知，氢能是一种高效、零污染的清洁能源。可以通过电解水、利用化石能源(如石油裂解制合成气、天然气制氢等)等方法获得氢气。前者能量消耗大，后者受原料价格影响，制氢成本高，应用都受到限制。生物制氢过程条件温和，制氢原料主要为各种废弃的生物质资源，原料来源广泛，廉价易得。因此，生物制氢具有良好的发展前景。生物制氢包括光驱动与厌氧发酵两种方式。绿藻和蓝藻等可通过直接或间接光解水制氢，这两种制氢过程都不能利用有机物，不能减少有机废弃物的污染，同时都需要光照，并且水光解产生的氧气对反应有抑制效应。光合细菌如深红螺菌、深红假单胞菌等可以在光照条件下，利用各种小分子有机酸产生氢气，该过程不存在氧的抑制，但产氢过程需要光照，光能利用率低，也不易进行放大试验。与前三种生物制氢方法相比，暗发酵制氢具有不受光照限制、产氢速率快、稳定性好、发酵设备简单、可利用底物范围广等优点。尤其采用天然混合菌源暗发酵产氢过程，对培养条件要求相对较低，在发酵制氢前不需要对底物进行灭菌处理，更适合工业放大。

目前，暗发酵制氢实现产业化的关键在于底物转化率低，只有探索提高氢转化率的方法和途径，降低暗发酵制氢的生产成本才能促进其早日实现工业化。

日本学者Tanisho等发现兼性厌氧菌Enterobacter aerogenes可以通过甲酸裂解途径及细胞内NADH再生途径产氢。目前，在微生物发酵产氢中对胞内NADH/NAD⁺的调控主要分为内源基因工程改造和外源生化过程调节两种。徐方成通过敲除adhE基因构建得到基因工程菌K.oxytoca ME-3，其甲酸裂解途径产氢活性不变，而NADH途径产氢活性提高，与野生菌株相比总产氢量提高9％。由于辅酶在胞内代谢中的分布相当复杂，对其进行基因改造具有极大的盲目性，尤其对于基因背景信息不确定的菌株，很多情况下难以达到预期的目的。而另一种方法—外源生化过程调节可以作为有效的替代方法。利用生化工程的手段，即采用胞外控制的策略来实现胞内辅酶状态及代谢流的改变。清华大学的张翀在研究Enterobacter aerogenes“NADH途径”产氢的分子机制的基础上，采用外源添加NAD⁺的方法能够强化菌株的产氢代谢，使连续培养体系的产氢率由1.41mol/mol-葡萄糖提高到1.52mol/mol-葡萄糖，产氢量提高了7.8％。张翀等在后续研究中发现，在连续培养时，外源NADH的添加导致菌株“NADH途径”产氢减弱，而“甲酸途径”增强，最终总产氢量降低。而外源添加NAD⁺，效果刚好相反。上述研究结果表明，外源NADH和NAD⁺的添加可能会影响胞内NADH/NAD⁺比值发生改变，进而影响NADH代谢途径。