[发明专利]一种神经干细胞的无血清冻存液

说明书

技术领域

本发明涉及干细胞培养技术领域，具体地说是一种神经干细胞的无血清冻存液。

背景技术

神经干细胞是指来源胚胎和成体脑、脊髓等神经组织中分离培养的一种干细胞，是具有分裂潜能和自我更新能力的一类母细胞，能分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，可提供大量神经组织细胞的干细胞。因此培养神经干细胞旨在获得足够数量的具有增殖及分化潜能的神经干细胞，以进行中枢神经系统功能损害的治疗和攻击肿瘤的生长的治疗等。目前大量临床前实验研究表明神经干细胞对于脑中风和创伤性脑损伤有一定的治疗效果，并取得令人鼓舞的实质性进展。

神经是人身体中复杂和高度分化的组织，神经干细胞的培养难度高，在培养过程中容易出现自发分化，从而很快就失去干性和分化功能。所以目前有大量神经干细胞体外培养的研究，均旨在培养高质量和数量的神经干细胞，但也存在受冻存条件限制而不能大规模应用的问题，干细胞冻存过程中无外源性污染是神经干细胞在临床治疗应用中安全可靠的关键，一方面由于常规冻存液中的胎牛血清含有各种不明确的细胞生长因子，会对细胞的分化形成干扰，在不明生长因子、营养因子或其他细胞因子的刺激下，细胞内关键的信号通路被激活。另一方面采用动物血清冻存的干细胞进行临床应用，可能引起病原体的交叉感染，因此需要开发成分明确的人神经干细胞的无血清冻存液。

近年来的研究发现，一些中草药来源的天然产物能促进神经干细胞的增殖，揭示了这些中药益智作用的可能机制。现代药理学研究表明，天麻具有神经保护功能，改善衰老、健忘和脑缺血模型动物的学习记忆能力。最新研究表明天麻的单体化合物影响神经干细胞的增殖和自我更新。

人神经干细胞的长期活性与冻存坏境有密切关系，冻存液的微环境对人神经干细胞有着重要影响，当细胞微环境出现变化的时候可直接影响干细胞的形态、增殖、分化、凋亡和衰老。优化干细胞的冻存条件将为干细胞技术的规范化应用起到积极意义。

发明内容

本发明的技术任务是解决现有冻存条件的不足，提供一种神经干细胞的冻存液，解决常规冻存液中胎牛血清带来的动物源性成分和病原体污染问题，减少细胞死亡并维持干细胞特性。神经干细胞使用无血清冻存液保存在液氮中14天，细胞重新复苏后贴壁率达到90%以上，死细胞很少，大大提高了细胞的活性与数量，同时流式细胞术检测细胞表型时, 通过分析神经干细胞特异性标记物(Nestin,Sox1和Sox2）、巨细胞特异性标记物（CD44）、星形胶质细胞特异性标记物（GFAP）、神经元特异性标记物（DCX）和细胞增殖标记物（Ki-67）的表达，干细胞特性也没有发生变化。

设计一种人神经干细胞的无血清冻存液，其混合溶液体系中成分的百分比为：含有人神经干细胞的无血清培养基65%-75%、中药天麻来源的单体化合物溶液3-5.5%、二甲基亚砜9-12%，腺苷3-5.5%、以及人神经干细胞来源的外泌体溶液2.5-5%和人神经干细胞来源的短肽和多肽类化合物溶液2.5-5%。

人神经干细胞的无血清培养基的配制可以选择不同体积百分比的无血清培养基建立储存体系，优化后分别配制体积百分比为65%、67%、69%、71%，73%，75% 的冻存液体系。

人神经干细胞无血清培养基包括基础培养基和添加营养因子成份，其中基础培养基为Alpha-MEM培养基，根据需要添加如下成份： 营养因子A1（50 ng/mL），营养因子B1（50 ng/mL），4-羟乙基呱嗪乙磺酸（5mg/mL），血小板源性细胞因子（50 ng/mL），表皮生长因子（50 ng/mL），碱性成纤维生长因子（50 ng/mL），细胞因子抗体E（20 ng/mL），细胞因子抗体F（20 ng/mL），细胞因子抗体M（20 ng/mL）。

加入浓度为2mmol/L浓度的中药天麻来源的单体化合物ZTD1，ZTD1溶液的体积百分比分别优化为3%，3.5%，4%，4.5%，5%，5.5%。

加入浓度为4mmol/L浓度的腺苷，腺苷的体积百分比分别优化为3%，3.5%，4%，4.5%，5%，5.5%。

在冻存液体系中，加入浓度为400ng/mL人神经干细胞来源的外泌体，人神经干细胞来源的外泌体溶液体积百分比分别优化为2.5%，3%，3.5%，4%，4.5%，5%。

在冻存液体系中，加入400ng/mL的浓度人神经干细胞来源的短肽和多肽类化合物，人神经干细胞来源的短肽和多肽类化合物溶液的体积百分比分别优化为2.5%，3%，3.5%，4%，4.5%，5%。