[发明专利]一种人EGFR基因四重多位点突变检测试剂盒及方法

说明书

本发明一种人EGFR基因四重多位点突变检测试剂盒及方法是基于三荧光通道数字PCR方法设计的精准检测人EGFR基因突变位点的试剂盒。本试剂盒及方法利用特异的TAQMAN探针，针对EGFR基因L858R、L861Q、E19缺失和T790M四重突变区域，在单管反应液中同时检测涉及EGFR‑TKI药敏和耐药的共22个突变位点，并且可以根据突变DNA的拷贝数判定模板类型。针对人EGFR基因19号外显子缺失突变，本试剂盒及方法还包括一种特异修饰的阻遏核苷酸探针，其可以与野生型DNA结合，从而确保检测到的荧光微珠均为突变DNA的信号，之后再根据突变DNA的拷贝数判定模板的类型。本发明中涉及到的试剂盒及方法克服了以往EGFR基因突变检测中繁琐和灵敏度低等问题，大大提高了人EGFR基因突变检测的稳定性、特异性和灵敏度。

技术领域

本发明涉及一种EGFR基因四重多位点突变检测试剂盒及方法，属于生物医学核酸检测技术领域。

背景技术

随着现代生活水平和质量的提高，现代疾病也呈现发展的态势，尤其是恶性肿瘤的发病率在我国 已经呈现逐年迅速上升的状况。其中，基因产生的突变是癌症高发的重要因素，而分子靶向药物专门针对 基因产生突变引发的癌症发挥功效。靶向药物(也称作靶向制剂)是指被赋予了靶向(Targeting)能力的 药物或制剂。其目的是使药物或其载体能瞄准特定的病变部位，并在目标部位蓄积或释放有效成分。靶向 制剂可以使药物在目标局部形成相对较高的浓度，从而在提高药效的同时抑制毒副作用，减少对正常组织 或细胞的伤害，目前的靶向药以分子靶向药类居多。肺癌靶向药物的出现让非小细胞型肺癌(nonsmall-cell lung cancer，NSCLC)患者的生存时间和生活质量都有了显著的提升。对于肺癌患者，尤其是晚期患者， 靶向治疗相较于化疗、放疗，可以很大程度地延长患者生命，并且给患者带来的治疗损伤较小。之前已经 有许多研究表明EGFR基因产生的突变与酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosine Kinase Inhibitor，TKI)的关系密切， 其中外显子21上的替代突变(L858R)占EGFR基因总敏感突变的45％，外显子19缺失突变占EGFR基 因总敏感突变的50％。EGFR敏感突变已成为癌症患者是否对TKI敏感的强预测因子，有研究表明，EGFR 发生敏感突变的患者中，大约有75％对TKI治疗有反应。其中以吉非替尼(gefitinib)和厄洛替尼(erlotinib) 为代表的靶向药物取得了良好的疗效。目前，美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration，FDA) 以及美国国立综合癌症网络(NationalComprehensive Cancer Network，NCCN)指南已规定TKI药物的治 疗必须要依据EGFR基因的检测结果来选择治疗对象，要筛选最合适的患者进行有针对性的靶向治疗以提 高药物疗效。目前，我国已有的“EGFR突变NSCLC治疗之中国共识”、“中国NSCLC患者EGFR基因突 变检测专家共识”以及CFDA也规定TKI药物的治疗必须先进行EGFR基因突变的伴随诊断，只有具有 EGFR敏感突变的患者才能进行后续的EGFR-TKI治疗。因此，当前首先检测EGFR基因的突变状态是决 定患者是否能够使用EGFR-TKI治疗的先决条件。但是，一代/二代EGFR-TKI靶向药物治疗平均8-14个 月后，多数患者会陷入新的困境——继发性耐药，其中EGFR基因的T790M突变是耐药现象产生的主要 原因，该突变发生概率在44～86％。研究还发现，T790M突变不仅存在于TKI治疗后的患者标本中，也 存在于TKI治疗前的患者标本中。因此，对于TKI耐药的非小细胞型肺癌(non-small cell lung cancer， NSCLC)患者，如何根据突变的类型和突变的丰度，在合适的时间进行合适的治疗是目前迫切需要解决的 问题。如果通过基因检测，发现患者产生了T790M的耐药突变，则可以选择服用国内已经上市的靶向药物奥希替尼(AZD9291)来进行治疗。奥希替尼是阿斯利康的第三代靶向EGFR-TKI药物，针对T790M 突变导致的耐药性有很好的疗效。因此，对EGFR基因的T790M耐药突变的动态监测，已成为目前及时 发现耐药患者从而采取最佳治疗策略的关键所在。