[发明专利]一种核壳型纳米二氧化硅荧光探针及其合成方法和应用

权利要求书

1.一种核壳型纳米二氧化硅荧光探针，其特征在于，其是核壳结构的纳米颗粒，所述核壳结构包括如式(I)所示的内核荧光染料和如式(II)所示的外壳染料，所述纳米颗粒的结构如式(III)所示；

2.权利要求1所述核壳型纳米二氧化硅荧光探针的合成方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)罗丹明B与烯丙基溴按照1:12的摩尔比溶解于干燥DMF中，加入催化剂Cs₂CO₃，在氮气保护下加热至80℃，反应过夜后，将反应物加入二氯甲烷中，用盐水洗涤有机相三次，用无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸馏去除有机溶剂，通过硅胶柱分离得到如式(I)所示的内核荧光染料；

(2)3-氨丙基三乙氧基硅烷与甲基红按照摩尔比1:1～1:5溶解于干燥DMF中，保持体系在氮气保护下进行，加入催化剂PyBOP和4-二甲氨基吡啶，冰浴反应1h，随后撤掉冰浴，室温下搅拌24h，减压蒸出有机溶剂，分离提纯得到如式(II)所示的外壳染料；

(3)正硅酸乙酯与3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷按照50:1的体积比溶解于干燥乙醇中，搅拌均匀后，加入催化剂氨水和去离子水，氨水与去离子水体积比为1:1，常温搅拌12个小时后，高速离心分离，弃去上清液后超声分散在干燥乙醇中，离心洗涤三次，再分散于干燥乙醇中，得到表面修饰后的二氧化硅纳米颗粒SiO₂-NPs；

(4)在搅拌下将如式(I)所示的内核荧光染料加入到SiO₂-NPs乙醇溶液中，加热至70℃氮气条件下搅拌1h，再加入催化剂过硫酸钾引发聚合，反应在70℃下继续反应4h后终止反应，产物在高速离心机中分离得到，用水和乙醇洗涤离心数次至上清无颜色，得到中间产物NP-1；

(5)将中间产物NP-1分散于干燥乙醇中，在剧烈搅拌下加入氨水和去离子水，体积比为1:5，搅拌45分钟后，缓慢滴加如式(II)所示的外壳染料Methyl-S的乙醇溶液，氮气保护室温下继续搅拌24h，产物在高速离心机中离心分离得到，用水和乙醇洗涤离心数次至上清液无颜色，最终得到如式(III)所示纳米颗粒。

3.权利要求1所述核壳型纳米二氧化硅荧光探针在选育具有偶氮染料降解活性微生物中的应用。

4.一种具有偶氮染料降解活性微生物的选育方法，其特征在于，包括如下步骤：

将不同类型的实验菌株培养至对数期，离心收集菌体，用PBS缓冲液洗涤数次，用PBS重悬菌液调整OD₆₀₀至菌液浓度为1*10⁸，各种实验菌株等量混合于无机盐培养基中，加入如权利要求1所述的核壳型纳米二氧化硅荧光探针共同培养3h后，离心收集菌体，用PBS洗涤、重悬菌液，后上流式细胞仪进行分选，得到具有偶氮染料降解活性的微生物。

5.根据权利要求4所述的具有偶氮染料降解活性微生物的选育方法，其特征在于，所述流式细胞仪使用激发波长为555nm，发射波长为576nm，信号收集通道选用DsRed通道。

6.根据权利要求4所述的具有偶氮染料降解活性微生物的选育方法，其特征在于，所述流式细胞仪进行分选时，选取荧光信号强度最强的前5-10％的细菌作为具有偶氮染料降解活性微生物。