[发明专利]交替假单胞菌生态菌剂的制备

说明书

技术领域

本发明涉及一种交替假单胞菌生态菌剂的制备。

背景技术

长期以来对于水产养殖病害的防治以使用抗生素和其它化学药物为主要措施，但化学治疗有许多弊端，破坏水体的微生态环境，存在药物残留，影响水产品品质以及对环境造成污染等问题。据不完全统计，全国每年海洋水产养殖病害发病率达60％以上，损失率20％左右，直接经济损失就达百亿元之巨，并且还有上升的趋势。如何通过改善整个养殖水体生态环境，抑制病原微生物生长，减少疾病的发生已成为世界各国水产养殖业所共同关注的焦点问题。近年来，人们开始尝试在养殖水体中施用益生微生物来改善养殖微生态环境。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于改善海水养殖动物水体的微生态环境，预防养殖病害，提高养殖动物成活率的一种有益菌剂—交替假单胞菌生态菌剂的制备。以减少抗生素和其他化学药物的使用，降低养殖费用，减少污染，维护生态平衡。

本发明的另一个目的是将可规模发酵生产的该有益菌剂合理使用。

本发明的制备方法是先从健康对虾扇贝等海水养殖动物的体表分离出对常见致病菌有拮抗作用的菌落。纯化后进行对海水养殖动物的安全性检验以及对增强海水动物抗病能力方面的检验，并对该菌的保存和发酵条件优化，以发酵罐中按照优化的条件进行大量的生产，最后通过离心浓缩后制备成一定浓度的菌剂，进行合理使用。

本发明是一种微生物控制技术，是利用微生物普遍存在的拮抗现象，即利用在同一生态位中微生物通过营养竞争、空间竞争或分泌抗生素、细菌素等毒素抑制其他微生物的生长这一原理，将具有拮抗特性的益生菌施入养殖水体，杀死或抑制病原微生物，为养殖动物营造良好的生存环境。通过使用该菌剂可改善养殖水体的生态环境，抑制病原微生物的生长，减少病害的发生，降低养殖成本和提高养殖动物地成活率并且该菌剂具有不污染环境等环保特点。这种效益将是潜在的，长期的，这将成为未来水产养殖业中的一个重要研究和发展方向。

具体实施方式

下面通过具体实施例进一步说明本发明。

本发明的菌剂制备方法分为四大步骤，其中分离纯化及检验和筛选，即步骤A、B、C在于得到有效菌株，最后步骤D是培养和发酵，以利规模化生产该菌剂，下面详细叙述，以方便实施。

A、首先分离纯化出交替假单胞菌落，即捕获健康的对虾个体(50～100g)等养殖动物，迅速将其放置于盛有灭菌海水的无菌容器中进行如下操作：用无菌海水冲洗其表面3次，每次不超过30秒，然后再将其放置在无菌海水中，剧烈震荡2～5分钟，用无菌器械将养殖动物取出后，从中吸取50～100ml海水无菌操作涂布在以灭菌海水配置的灭菌的固体培养基(2216E)上，在25～30℃进行培养48小时，选取其中呈桔黄色的菌落分别通过革兰氏染色和鞭毛染色，以选其中具有革兰氏阴性和极生单鞭毛的直杆状特征的菌落。

B、然后再进行对常见海水养殖动物致病菌的拮抗性检验：检验的方法是首先选取可在海水培养基2216E上生长的海水养殖常见的细菌性病害病原菌如鳗弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌、溶藻胶弧菌、霍乱弧菌非O1型、创伤弧菌、漂浮弧菌，河弧菌，最小弧菌，杀鲑弧菌，病海鱼弧菌，迟钝爱德华氏菌，海水屈挠杆菌，变异微球菌，分支杆菌以及肠杆菌等作为指示菌，再采用十字交叉划线法，将待检测菌和指示菌相互垂直交叉划线接种于2216E平板上，25～30℃下培养24～36小时。选取对大多数菌都有拮抗活性的菌株，即得到交替假单胞菌。

C、再将纯化后的具有拮抗作用的菌株按下列方法进行进一步筛选：

a、安全性检测：.以筛选的菌株进行对海水养殖动物的安全性实验：可选取海水养殖动物不同时期的个体分组进行(例如对虾不同时期的幼虾，稚虾或成虾)施用不同剂量103-105cfu/ml筛选菌株于养殖水体，以不加任何菌剂的组为对照，从中选取在各种剂量组(103-105cfu/ml)施用后养殖动物存活率较高的菌株。

b、提高抗病力检测：各种对养殖动物施用该菌，以剂量在103-105cfu/ml，同时在养殖动物水体中加入已经被证实为病原的细菌(例如哈维氏弧菌，鳗弧菌等)105cfu/ml，共同培养一定的时间后检察对养殖动物的保护作用即成活率的高低。在生产过程中需要菌种保存，通常分中、长期菌种保存

长期保存：在2216E固体斜面划线培养24小时后。用无菌的生理盐水冲洗到无菌的安瓿瓶，无菌冷冻干燥，密封长期保存5～10年。