[发明专利]一种基于疏水性氨基酸特异性蛋白酶的蛋白质分析方法

说明书

本发明提供一种基于疏水性氨基酸特异性蛋白酶的蛋白质分析方法，该方法首先采用短链疏水性氨基酸特异性蛋白酶对蛋白质疏水性结构区域进行高效酶解，然后采用液相色谱‑质谱分析技术对酶切产生的肽段进行高通量序列测定。本方法所采用的短链疏水性氨基酸特异性蛋白酶的酶切位点主要是丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸等短链疏水性氨基酸，针对以上四种氨基酸的酶切特异性高达85％。本发明显著提高负责生物样品中蛋白质的鉴定数量以及蛋白质序列分析的覆盖率，有利于对蛋白质翻译后修饰信息的准确分析，提高了蛋白质组学分析技术的准确性和应用范围。

技术领域

本发明属蛋白质分析领域，具体涉及一种基于疏水性氨基酸特异性蛋白酶的蛋白质分析方法。

背景技术

蛋白质是生命活动的主要承担者，其种类、丰度及其翻译后修饰的改变都将直接影响细胞功能。现阶段基于液相色谱-质谱的蛋白质组学分析技术通常需要将蛋白质降解为易于分析的多肽。蛋白酶是一类可以将蛋白质水解成多肽的酶。蛋白酶对于底物的选择有高度的选择性，一种蛋白酶仅能水解蛋白质序列中含有特定的一种或者多种氨基酸的肽键。如在蛋白质分析领域应用最为广泛的胰蛋白仅可以特异性酶切含有精氨酸(Arginine，R)或者赖氨酸(Lysine，K)残基的肽键的C端。不同的蛋白酶串联或者并联使用可以显著提高负责生物样品中蛋白质的鉴定数量以及蛋白质序列分析的覆盖率，有利于对蛋白质翻译后修饰信息的准确分析。

当前的蛋白质组学分析技术主要采用的蛋白质水解酶有Trypsin，Arg-C，Lysine-C，Glu-C等(Zhang,Y.；Fonslow,B.R.；Shan,B.；Baek,M.C.；Yates,J.R.,3rd,Proteinanalysis by shotgun/bottom-up proteomics.Chem.Rev.2013,113(4),2343-94.)，其主要酶切位点为亲水性氨基酸赖氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸和谷氨酸等。因此，在采用液相色谱-质谱技术对酶切多肽进行测序时一般可以对富含亲水性酶切位点氨基酸的蛋白质区域进行高效序列覆盖测定，而对于以疏水氨基酸为主的蛋白质区域则序列覆盖率较低，极大降低了蛋白质组学分析技术的准确性(Tan,S.；Tan,H.T.；Chung,M.C.,Membraneproteins and membrane proteomics.Proteomics 2008,8(19),3924-32.)和应用范围。目前，还没有应用特异性针对疏水性氨基酸的蛋白质水解酶进行标准蛋白质或复杂蛋白质样品酶解和蛋白质组学分析的报道。

发明内容

本发明涉及一种特异性短链疏水性氨基酸特异性蛋白酶，其酶切位点主要为蛋白质内部疏水性区域的短链疏水性氨基酸，其可以实现对蛋白质疏水结构区域的高效酶解，有利于提高蛋白质分析的序列覆盖率。

本发明一种基于疏水性氨基酸特异性蛋白酶的蛋白质分析方法，首先采用短链疏水性氨基酸特异性蛋白酶对蛋白质的疏水性区域进行高效酶解，然后采用液相色谱-质谱分析技术对酶解产生的多肽进行高通量分离和序列测定。

一种基于疏水性氨基酸特异性蛋白酶的蛋白质分析方法，具体步骤为：

(1)将蛋白质分散在25～200mM三(羟甲基)氨基甲烷(Tris-HCl)，8M尿素(Urea)或6M盐酸胍，10～200mM氯化钠(NaCl)，1～20mM氯化钙(CaCl₂)组成的变性缓冲液中，pH为5～9；蛋白质浓度保持在0.01～10mg/mL之间；

(2)在上述步骤(1)得到的蛋白质溶液体系中加入二硫苏糖醇(DTT)，终浓度为5～40mM，在25～100℃孵育5～120min，再加入碘代乙酰胺(IAA)，终浓度为10～80mM，20～37℃避光孵育20～40min，打开二硫键；