[发明专利]一种检测血清中尿微量白蛋白含量的试剂盒及其制备方法

权利要求书

1.一种检测血清中尿微量白蛋白含量的试剂盒，其特征在于，包括：抗试剂A、抗试剂B、磁微粒试剂、校准品、质控品、发光底物液；

其中，所述抗试剂A是碱性磷酸酶标记的尿微量白蛋白衍生物，含BSA的抗试剂A缓冲液；所述碱性磷酸酶标记的尿微量白蛋白衍生物是通过偶联剂将尿微量白蛋白衍生物和碱性磷酸酶偶联后获得，浓度为0.2ug/mL；所述抗试剂A缓冲液为10～100mM的Tris-HCl溶液，pH值为7-8，含有浓度为2-6wt％的PEG-6000、0.7-0.9wt％的氯化钠、0.05-0.1wt％的叠氮钠、0.3wt％的PC-300、0.1-1wt％牛血清白蛋白以及20mM EDTA；

所述抗试剂B是FITC标记的尿微量白蛋白多克隆抗，含BSA的抗试剂B缓冲液；所述FITC标记的尿微量白蛋白抗体是通过偶联剂将尿微量白蛋白抗体和FITC偶联后获得，浓度为1.0ug/mL；；所述抗试剂B缓冲液为10～100mM的Tris-HCl溶液，pH值为7-8，0.12wt％的ANS、2-6wt％的PEG-6000、0.7-0.9wt％的氯化钠、0.05-0.1wt％的叠氮钠、0.3wt％的PC-300、0.1-1wt％牛血清白蛋白以及20mM EDTA；

所述磁微粒试剂是包被有FITC抗体的羧基磁微粒混悬液；羧基磁微粒用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺在pH4.5-pH5.5下活化，加磁场，静置使磁微粒与液体分开，弃去上清，用pH7.6的0.01M的PBS缓冲液洗去多余化活化剂；加入适量的FITC多克隆抗体，使其浓度为0.5uL/mg磁微粒，在pH7.4-pH7.8下震荡反应，反应结束后加磁场，静置使磁微粒与液体分开，弃去上清，用含有1％牛血清白蛋白的0.01M的PBS缓冲液进行封闭，封闭结束后，加入封闭液以保存磁微粒，使磁微粒的最终浓度为2mg/ml；该磁微粒混悬液置于2-8℃保存，以备使用；

所述校准品和质控品由人源性尿微量白蛋白和缓冲液组成，缓冲液为浓度50-200mM的Tris-HCl溶液，含有浓度为0.1～1wt％的牛血清白蛋白、0.05～0.5wt％的PC-300、5～50mM的乙二胺四乙酸二钠；所述尿微量白蛋白校准品包括人源性尿微量白蛋白浓度分别为0、1.5、6.0、25、100、400ug/ml的一组校准品；

所述发光底物液是含有AMPPD的Tris-HCl溶液，所述Tris-HCl溶液的pH值为8.0～10.0，含有浓度20V％的AMPPD、16wt％的NaCl、0.4wt％的KCl和2.42wt％的Tris。

2.根据权利要求1所述的检测血清中尿微量白蛋白含量的试剂盒，其特征在于，所述偶联剂选自碳化二亚胺、戊二醛、二异氰酸化合物或二卤化二硝基苯中的一种或多种。

3.根据权利要求3所述的检测血清中尿微量白蛋白含量的试剂盒，其特征在于，所述FITC抗体选自人血清白蛋白、牛血清白蛋白、牛转铁蛋白和血蓝蛋白中的中的一种亚型或多种亚型的混合。

4.根据权利要求1所述的检测血清中尿微量白蛋白含量的试剂盒，其特征在于，所述羧基磁微粒为核壳结构，直径范围为100～4500nm，浓度为1～5mg/mL；所述羧基磁微粒的表面带有由羧基、氨基、羟基、酰肼基或氯甲基的一种或多种修饰的化学基团；所述FITC抗体通过羧基磁微粒携带的基团键合在羧基磁微粒表面。

5.根据权利要求1-4任一项所述的检测血清中尿微量白蛋白含量的试剂盒，其特征在于，还包括浓缩洗涤液，所述浓缩洗涤液是含有吐温20的Tris-HCl溶液，pH值为7.4，含有浓度16wt％的NaCl、0.4wt％的KCl、2.42wt％的Tris，使用时用双蒸水15倍稀释。

6.如权利要求5所述的检测血清中尿微量白蛋白含量的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

一、磁微粒试剂的制备：

1)、将羧基磁微粒用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺在pH4.5～pH5.5下进行活化，然后在磁场上静置使羧基磁微粒与液体分开，弃去上清；

2)用pH7.6的0.01M的PBS缓冲液洗去多余化活化剂，然后加入适量的FITC抗体，使FITC抗体的浓度为0.5uL/mg，在pH7.4～pH7.8下震荡反应；

3)反应结束后在磁场上静置使羧基磁微粒与液体分开，弃去上清，用含有1wt％牛血清白蛋白的0.01M的PBS缓冲液进行封闭；

4)封闭结束后，加入封闭液以保存磁微粒试剂，使包被有FITC抗体的羧基磁微粒的最终浓度为2mg/mL；该磁微粒混悬液置于2-8℃保存，以备使用；

二、抗试剂A的制备

尿微量白蛋白衍生物的制备

使用SMCC活化剂将尿微量白蛋白进行活化，生成马来酰亚胺-尿微量白蛋白衍生物；马来酰亚胺-尿微量白蛋白衍生物含有可以与-SH基团反应的马来酰亚胺基团，加入含有-SH的碱性磷酸酶，将ALB衍生物与碱性磷酸酶连接在一起，调整至工作浓度为1.0ug/mL；

抗试剂A缓冲液的制备

将9gNaCl、0.5g叠氮钠、3gPC-300、10g牛血清白蛋白和5.84g EDTA溶于900mL双蒸水中，用HCl调整PH7.0-8.0，用双蒸水定容至1000mL；

三、抗试剂B的制备

将1.2gANS、9gNaCl、0.5g叠氮钠、3gPC-300、10g牛血清白蛋白和5.84g EDTA溶于900mL双蒸水中，用HCl调整pH7.0～8.0，用双蒸水定容至1000mL，获得含BSA的缓冲液；

在BSA缓冲液中，25℃条件下，FITC与尿微量白蛋白抗体产生偶联反应，经过蛋白纯化仪纯化，收集包被有FITC的尿微量白蛋白抗体，经过紫外分光光度计检测包被有FITC的尿微量白蛋白抗体的浓度，调整至工作浓度为1.0ug/mL；

四、校准品和质控品的制备

用含有终浓度0.1-1wt％的牛血清白蛋白、0.05-0.5wt％的PC-300、5-50mM的乙二胺四乙酸二钠的BSA缓冲液将人源性尿微量白蛋白纯品配制成浓度为0ug/mL、1.5ug/mL、6.0ug/mL、25ug/mL、100ug/mL、400ug/mL的一系列校准品；

用含有终浓度0.1-1wt％的牛血清白蛋白、0.05-0.5wt％的PC-300、5-50mM的乙二胺四乙酸二钠的BSA缓冲液将人源性尿微量白蛋白纯品配制成浓度为2.5ug/mL、20ug/mL的质控品；

五、发光底物液的制备

将200mL AMPPD、160gNaCl、4gKCl、24.2g三羟甲基氨基甲烷溶于900mL双蒸水中，用HCl调整PH8.0～10.0，用双蒸水定容至1000mL；

六、浓缩洗涤液的制备

将160NaCl、4gKCl、24.2g三羟甲基氨基甲烷、1mL吐温20溶于900mL双蒸水中，用HCl调整至PH7.4，用双蒸水定容至1000mL，使用时用双蒸水15倍稀释。