[发明专利]一种整合microRNA和CAR功能的载体构建方法

权利要求书

1.一种整合microRNA和CAR功能的载体构建方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）构建含有hsa-miR-301a的阻遏物sponge-miR-301a的载体，并由H1启动子驱动；

所述阻遏物sponge-miR-301a的序列如序列表SEQ ID NO.2所示；

构建含有CD19-CAR由EF1α驱动并包括：CD19的单链抗体可变区基因片段序列，CD8来源的连接和穿膜片段序列，传递信号的效应分子CD3ζ序列和胞内信号分子CD28和4-1BB片段序列组成，所述CD19-CAR的序列如序列表SEQ ID NO.3所示；

（2）采用合成、酶切、连接和转化的方法，将hsa-miR-301a的阻遏物和CD19-CAR结构序列连接到含有H1和EF1α的第三代FIV载体上，得到pFIV-miR-301a-CD19CAR，将连接产物转入大肠杆菌感受态DH5α中进行大量扩增并提取质粒；

采用质粒载体引物进行PCR和测序验证连接序列的正确性，其中hsa-miR-301a阻遏物测序引物序列为：5’-TGTCTTTGGATTTGGGAATCTTAT-3’；

CD19-CAR测序引物为：5’-ATTTATTGTATCTGTGGGAGCCTC-3’；

（3）共转染质粒pFIV-miR-301a-CD19CAR和FIV慢病毒包装质粒于293T细胞，收集293T细胞上清，并制备慢病毒颗粒，感染Jurkat细胞，采用荧光定量PCR检测hsa-miR-301a表达，流式细胞技术检测myc-tag标签来显示CD19-CAR在细胞膜的表达水平；

所述FIV慢病毒包装质粒包括pFIV-34N和pVSV-G质粒。