[发明专利]一种基于细菌表面展示系统的重组融合蛋白及其应用

说明书

本发明公开了一种基于细菌表面展示系统的重组融合蛋白及其应用，该重组融合蛋白包括冰核蛋白N端结构域、荧光蛋白、抗性蛋白和人存活素蛋白或其突变体。本发明以冰核蛋白N端结构域为细菌表面锚定元件使重组融合蛋白中人存活素蛋白或其突变体通过INP表面展示系统在细菌表面活性表达，解决了现有技术中外源蛋白在大肠杆菌细胞内表达需涉及破菌纯化等繁杂的后续步骤的问题，为制备进一步研制关于人存活素蛋白或其突变体的肿瘤标志物和疫苗奠定了基础。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种基于细菌表面展示系统的重组融合蛋白及其应用。

背景技术

当前，恶性肿瘤仍然是极大危害人类生命健康的严重疾病。尽管近年来随着肿瘤生物学和免疫学等基础研究的进步，肿瘤手术、化疗、放疗及生物治疗的疗效在某些类型的肿瘤中已经有显著提高，但肿瘤患者生存率提高的关键仍有赖于肿瘤的早期发现和早期诊断。而未来肿瘤早期预防，则有赖于研制有效的肿瘤疫苗。

肿瘤诊断的关键是发现适当的肿瘤标志物，这其中肿瘤抗原及其相应抗体是重要的肿瘤诊断标志物。目前在临床上，检测甲胎蛋白(AFP)和癌胚抗原(CEA)已广泛用于诊断肝癌和消化道肿瘤及其预后监测。然而，迄今为止，具有实用价值的广谱肿瘤标志物仍十分罕见。

存活素(Survivin)是凋亡抑制蛋白(IAP)家族的成员之一，它广泛表达于几乎所有的肿瘤细胞，而在大多数正常细胞却未见表达(Andersen MH,et al.The universalcharacter of the tumor-associated antigen survivin.Clin Cancer Res.2007Oct15；13(20):5991-4)；存活素是一高度特异的广谱肿瘤相关抗原。

大量实验证明，检测体液中的存活素抗原或抗体，对肿瘤诊断及预后判断，具有重要价值(Tian P,et al.Diagnostic value of survivin for malignant pleuraleffusion:a clinical study and meta-analysis.Int J Clin Exp Pathol.2014Aug 15；7(9):5880-7)。例如，马丽等采用原核系统表达和纯化人存活素蛋白，建立基于存活素融合蛋白的间接ELISA方法，对89例健康志愿者、215例非小细胞肺癌患者以及20例肺部良性疾病患者的血清样本进行检测。结果表明，间接ELISA方法检测存活素自身抗体在非小细胞肺癌患者血清中的阳性率为19.5％，特异性为88.9％，存活素自身抗体与非小细胞肺癌患者的肿瘤大小、远处转移间存在相关性(P0.05)(马丽等.非小细胞肺癌患者中Survivin抗体的临床意义及诊断价值.中国肺癌杂志，2010；13:706-712)。

开发基于存活素抗体的检测系统以辅助肿瘤诊断，需采用基因工程方法获取大量纯化的存活素蛋白。如上所述，迄今为止多采用原核(主要是大肠杆菌)表达系统表达纯化存活素蛋白，但这一过程需经繁复的破菌处理和后续纯化步骤，往往还需繁琐的蛋白质变性-复性步骤，耗时费力，事倍功半。