[发明专利]一种短片段核酸链检测方法和预扩增方法

权利要求书

1.一种短片段核酸链检测方法，该方法包括反转录步骤和核酸扩增步骤，其特征是，反转录时通过TSO序列模板转换加长目标序列5’端，通过反转录引物识别目标序列并加长目标序列3’端，从而加长了检测模板的两端能够用来设计专一性引物的序列长度；核酸扩增时为反转录产物设计5’和3’专一性引物，5’专一性引物跨越TSO序列和目标序列衔接部分，3’专一性引物跨越目标序列和反转录引物衔接部分。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其中，反转录引物为茎环结构或线性结构，长度大于15个碱基，其3’端引入与目标序列互补的4-8个碱基，另外，目标序列5’端通过具有模板转换特性的反转录酶引入一种6个碱基以上的人工合成TSO序列。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其中，反转录引物的3’端引入与目标序列互补的6-8个碱基。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的检测方法，其中，TSO序列其5’末端包括一个可避免多次模板转换的终止基团；3’末端为若干个G碱基。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其中，终止基团为生物素。

6.根据权利要求4所述的检测方法，其中，TSO序列引入修饰碱基LNA。

7.一种短片段核糖核酸链检测方法，包括以下步骤：

第一步：提取样本RNA或裂解样本；

第二步：样本RNA反转录，所使用的反转录组分包括适当浓度的茎环结构或线性反转录引物，其3’端有4-8个碱基与目标序列互补、TSO序列：6个碱基以上的TSO序列、具有模板转换特性的反转录酶、含或不含dUTP的dNTP、RNA酶抑制剂、缓冲液；

第三步：cDNA扩增，所使用的cDNA扩增组分包括适当浓度的成对专一性引物、第二步反转录产物、DNA聚合酶、含或不含dUTP的dNTP、镁离子、缓冲液，其中所述专一性引物对应目标序列反转录产物，5’专一性引物跨越TSO序列和目标序列衔接部分，3’专一性引物跨越目标序列和反转录引物衔接部分。

8.根据权利要求7所述的检测方法，其中，TSO序列其5’末端包括一个可避免多次模板转换的终止基团；3’末端为若干个G碱基。

9.根据权利要求7或8所述的检测方法，其中，TSO序列5’末端包括一个生物素基团。

10.根据权利要求9所述的检测方法，其中，TSO序列引入修饰碱基LNA。

11.根据权利要求7所述的检测方法，其中，反转录步骤在反转录引物上引入dU，反转录后添加UNG酶裂解反转录引物。

12.根据权利要求7所述的检测方法，其中，采用一个兼具模板转换、反转录和DNA聚合酶特性的酶或将反转录酶和DNA聚合酶混合在一个体系中，第二步反转录和第三步cDNA扩增在同一个体系、同一步反应内进行。

13.一种短片段脱氧核糖核酸链(DNA)检测方法，包括以下步骤：

第一步：提取样本DNA或裂解样本；

第二步：样本DNA预扩增，所使用的扩增组分包括适当浓度的一个或多个预扩增引物：3’端有4-8个碱基与目标DNA的一条链互补、TSO序列：6个碱基以上的TSO序列、具有模板转换特性的DNA聚合酶、含或不含dUTP的dNTP、缓冲液；

第三步：样本DNA正式扩增，所使用的DNA扩增组分包括适当浓度的一对或多对专一性引物、第二步预扩增产物、DNA聚合酶、含或不含dUTP的dNTP、镁离子、缓冲液，其中所述专一性引物对应预扩增产物，5’专一性引物跨越TSO序列和目标序列衔接部分，3’专一性引物跨越目标序列和预扩增引物衔接部分。