[发明专利]一种组合二硫键的耐热突变脂肪酶及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种组合二硫键的耐热突变脂肪酶，其特征在于：是以S8-214脂肪酶为亲本，在与二硫键S8-214所在的1个或2个不同区域中/区域间引入1对效果提升较弱的二硫键，或在与二硫键S8-214所在的相同区域中同时引入1对或2对效果提升较强的二硫键；

所述的区域为β折叠头部区域，盖子1区域和β折叠尾部区域；其中，所述的β折叠头部区域为S8-214脂肪酶的第32位到第82位氨基酸序列；所述的盖子1区域为S8-214脂肪酶的第83位到第136位氨基酸序列；所述的β折叠尾部区域为S8-214脂肪酶的第1位到第11位氨基酸及第180位到第280位氨基酸；

所述的效果提升较强的二硫键为二硫键S2-210或S14-216；

所述的效果提升较弱的二硫键为二硫键S60-69或S122-196；

所述的组合二硫键的耐热突变脂肪酶为2N突变脂肪酶、2S突变脂肪酶、3N突变脂肪酶或3S突变脂肪酶；

2N突变脂肪酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

2S突变脂肪酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

3N突变脂肪酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；

3S突变脂肪酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2.编码权利要求1所述的组合二硫键的耐热突变脂肪酶的核苷酸序列，其特征在于：

所述的2N突变脂肪酶的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

所述的2S突变脂肪酶的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

所述的3N突变脂肪酶的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

所述的3S突变脂肪酶的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

3.权利要求1所述的组合二硫键的耐热突变脂肪酶的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）将二硫键进行区域组合，通过反向PCR突变，将所选出的氨基酸位点突变为半胱氨酸，并转入大肠杆菌中，进行扩增培养、质粒提取和测序；

（2）将测序正确的突变质粒以PmeⅠ限制性内切酶线性化处理，并电击转化至感受态毕赤酵母X33中，得到对应的突变工程菌；

（3）将突变工程菌在YPD液体培养基中进行扩增繁殖培养后，转接至BMGY液体培养基进行去抑制培养，最后接种BMMY液体培养基进行发酵，将菌液离心获取上清粗酶液；

（4）使用超滤管将粗酶液进行超滤浓缩后，使用镍柱一步法纯化，分离出带组氨酸标签的脂肪酶蛋白，并以还原性SDS-PAGE检测蛋白纯度，获取纯化后的组合二硫键的耐热突变脂肪酶。

4.根据权利要求3所述的组合二硫键的耐热突变脂肪酶的制备方法，其特征在于：

步骤（1）中所述的将二硫键进行区域组合的方法为：以S8-214脂肪酶为亲本，在与二硫键S8-214所在的1个或2个不同区域中/区域间引入1对效果提升较弱的二硫键，或在与二硫键S8-214所在的相同区域中同时引入1对或2对效果提升较强的二硫键；其中，所述的效果提升较强的二硫键为二硫键S2-210或S14-216；所述的效果提升较弱的二硫键为二硫键S60-69或S122-196。

5.根据权利要求3所述的组合二硫键的耐热突变脂肪酶的制备方法，其特征在于：

步骤（2）中所述的得到对应的突变工程菌还包括进一步通过博来霉素抗性平板筛选的步骤。

6.根据权利要求3所述的组合二硫键的耐热突变脂肪酶的制备方法，其特征在于，步骤（4）中所述的获取纯化后的脂肪酶后，还包括如下步骤：

（5） 通过DSF荧光检测测定突变脂肪酶的熔解温度；

（6） 通过p-NPP比色法测定突变脂肪酶的热稳定性指标：15 min半失活温度、55或60℃下的半衰期。