[发明专利]超声萃取‑固相萃取前处理结合液质联用技术同时检测畜禽粪便中六类24种抗生素的方法

权利要求书

1.一种超声萃取-固相萃取前处理结合液质联用技术同时检测畜禽粪便中六类24种抗生素的方法，其特征在于，按以下步骤进行：

(1)抗生素类物质的提取：超声萃取

称取经冷冻干燥、粉碎、过筛后的畜禽粪便，加入指示回收率的内标物，再加入提取溶剂，经超声萃取、离心后收集上清液即提取液，多次提取，合并提取液；用超纯水稀释合并后的提取液，过滤后待用；

(2)固相萃取前处理，即富集净化过程

依次用甲醇和等体积的超纯水活化固相萃取小柱，将经步骤(1)处理过的样品过柱即富集，控制水样流速；富集完成后依次用超纯水和等体积的低浓度甲醇淋洗，并在真空下干燥固相萃取柱；之后，再用甲醇洗脱，甲醇洗脱后用氮气吹干收集的洗脱液，得到残渣；将残渣用一定浓度的甲醇重新溶解，定容，经超声、过滤后转移至进样瓶中，待测；

(3)液相色谱串联质谱法测定粪便中六类24种抗生素的含量

采用内标法，在液相色谱-串联质谱仪上，定量检测进样瓶内的畜禽粪便样品中六类24种抗生素的含量；所述的六类24种抗生素是指磺胺类、四环素类、氟喹诺酮类、大环内酯类、酰胺醇类和青霉素类这六类的24种抗生素；24种抗生素分别为磺胺甲恶唑、磺胺嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲异恶唑、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、阿奇霉素、克拉霉素、红霉素、螺旋霉素、替米考星、环丙沙星盐酸盐、氟罗沙星、氧氟沙星、恩诺沙星、盐酸土霉素、金霉素盐酸盐、阿莫西林三水合物、青霉素G甲盐、甲砜霉素、氟甲砜霉素、氯霉素、盐酸氯苯胍。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，超声萃取前分别加入¹³C₁D₃-红霉素、D₅-诺氟沙星、¹³C₆-磺胺甲恶唑这三种内标物指示回收率。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，超声萃取前分别加入10μL，5mg/L的¹³C₁D₃-红霉素、D₅-诺氟沙星、¹³C₆-磺胺甲恶唑这三种内标物指示回收率。

4.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，提取溶剂为甲醇混合EDTA-Mcllvaine缓冲液，甲醇:EDTA-Mcllvaine缓冲液体积比为1:1。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的EDTA-Mcllvaine缓冲液的配制方法如下：称取柠檬酸12.9g，磷酸氢二钠27.5g，乙二胺四乙酸二钠37.2g，用超纯水定容至1L，用0.1mol/L的硫酸或氢氧化钠调节pH值至4±0.05，当天配制。

6.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，过滤所用的滤膜是孔径为0.45μm或0.47μm的Whatman GF/F系列玻璃纤维滤膜。

7.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的固相萃取柱是Waters公司Oasis HLB小柱，它是一种亲水-亲脂性聚合物填料柱，其吸附剂是用于酸性、中性和碱性化合物的通用型吸附剂；步骤(2)中，过柱时水样流速控制在1-4mL/min；洗脱HLB固相萃取柱的洗脱液流速小于1.0mL/min。

8.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，淋洗所用的低浓度甲醇为体积浓度小于10％的甲醇-水溶液；洗脱所用的甲醇为HPLC级甲醇；定容残渣所用的甲醇是体积浓度为70％的甲醇-水溶液；用甲醇定容后，超声5-15min，再用针式滤器过滤；针式滤器选用孔径小于0.22μm的聚四氟乙烯针式滤头。