[发明专利]一种快速分离培养人气道上皮细胞的方法及优化培养基

权利要求书

1.一种快速分离培养人气道上皮细胞的方法，其特征在于：包括如下步骤：

1)清洗人支气管或细支气管：取离体的肺脏组织，去除支气管或细胞支气管周围多余的脂肪和结缔组织后，用无菌的剪刀剪成块状于无菌离心管中，在4℃条件下用PBS缓冲液进行旋转漂洗10次，30min/次后，备用；

2)分离人气道上皮细胞：将清洗好的组织块置于冻存管中，加入预先配置好的消化液，在37℃条件下旋转消化40-60min后，待气管变软后且有细胞团块或单细胞时，将冻存管中的消化液和组织块一起转移至离心管中，加入胎牛血清至终浓度，盖上盖子，轻轻上下颠倒20次达到终止消化；所述预先配置好的消化液是由DMEM培养基、1％双抗、2.5μg/ml两性霉素B和15mg/mL链霉蛋白酶配制而成的；

3)收集人气道上皮细胞：将消化好的人气道上皮细胞，以1000r/min的转速离心5min，弃上清，沉淀的细胞用含10％胎牛血清的DMEM培养基进行悬浮；

4)去除成纤维细胞：将重悬的细胞接种到细胞培养皿中，在37℃，5％CO₂条件下的培养箱中培养2-4h后，去除成纤维细胞，得贴壁的细胞悬液；

5)再收集气道上皮细胞：将贴壁的细胞悬液于离心管中，以1000r/min的转速离心5min，弃上清，将沉淀的细胞用优化的培养基进行再悬浮；

6)获得原代培养的气道上皮细胞(P0)：将再收集的细胞接种于鼠尾胶原包被的细胞培养皿上，加入优化的培养基，置于37℃，5％CO₂的培养箱中培养2-3d后，进行换液，即得原代培养的气道上皮细胞(P0)；

7)传代培养气道上皮细胞：待获得的原代培养的气道上皮细胞的融合率达80-90％时，吸去培养基，用预热的PBS缓冲液漂洗后，加入accutase酶于37℃条件下消化5-10min，待细胞变圆后，轻轻拍打培养皿的侧壁；当细胞全部悬浮后，加入10％DMEM培养基进行终止消化，收集细胞悬液于离心管中，以1000r/min的转速离心5min，弃上清，细胞沉淀用优化的培养基进行悬浮；

8)获得传代培养P20以上的气道上皮细胞：将上述悬浮的细胞接种于鼠尾胶原包被的细胞培养皿上，加入优化的培养基，置于37℃，5％CO₂的培养箱中培养2-3d后，进行换液，即得分离培养的气道上皮细胞(P1)；待P1细胞融合率达到80-90％后，按照步骤7)进行传代培养，连续传代培养80d后，获得传代培养P20以上的气道上皮细胞；

所述优化培养基包括DMEM培养基、F-12NutirientMix培养基、0.5mg/ml的氢化可的松、胎牛血清、25ug/ml的表皮生长因子、5mg/ml的胰岛素、11.7uM的霍乱毒素、10mM的ROCK1抑制剂、10mM的BMP4拮抗剂。

2.根据权利要求1所述的快速分离培养人气道上皮细胞的方法，其特征在于：步骤1)中所述PBS缓冲液为预冷无菌的含有1％双抗和2.5μg/ml两性霉素B的溶液。

3.根据权利要求1所述的快速分离培养人气道上皮细胞的方法，其特征在于：步骤2)中所述加入胎牛血清的终浓度为5％。

4.根据权利要求1所述的快速分离培养人气道上皮细胞的方法，其特征在于：步骤6)和步骤8)中所述包被有鼠尾胶原的培养皿是在培养皿中加入适量浓度为50μg/mL的I型鼠尾胶原，室温包被24h后，用PBS缓冲液清洗3次即得。

5.根据权利要求1所述的快速分离培养人气道上皮细胞的方法，其特征在于：所述培养人气道上皮细胞的优化培养基按体积百分比计，由如下成分配制而成：

DMEM培养基 70～75％

F-12Nutirient Mix培养基 15～30％

0.5mg/ml的氢化可的松 0.001～0.005％

胎牛血清 5％～8％

25ug/ml的表皮生长因子 0.001～0.005％

5mg/ml的胰岛素 0.05～0.2％

11.7uM的霍乱毒素 0.001～0.005

10mM的ROCK1抑制剂 0.05～0.2％

10mM的BMP4拮抗剂 0.005～0.05％。