[发明专利]抗PD-1的纳米抗体PD-1/Nb52及其制备方法与应用

说明书

本发明公开了抗PD‑1的纳米抗体PD‑1/Nb52及其制备方法与应用。本发明所提供的纳米抗体，包含纳米抗体PD‑1/Nb52的抗原决定簇互补区和骨架区；所述纳米抗体PD‑1/Nb52的抗原决定簇互补区由CDR1、CDR2和CDR3组成；通过本发明所公布的纳米抗体PD‑1/Nb52的核苷酸序列及宿主细胞，该纳米抗体PD‑1/Nb52能够在大肠杆菌内高效表达，应用于PD‑1分子检测试剂的研发，制备抑制PD‑1活性以及制备肿瘤抑制剂或肿瘤细胞抑制剂和促进T细胞增殖的药物。

技术领域

本发明涉及生物医学领域中抗PD-1的纳米抗体PD-1/Nb52及其制备方法与应用。

背景技术

程序性死亡受体1(programmed death 1，PD-1)是活化T细胞表面表达的一种跨膜糖蛋白分子，属CD28超家族成员，对T细胞增殖起负性调节作用，在免疫应答中起重要调节作用。PD-1主要在激活的T细胞和B细胞中表达，是激活型T细胞的一种表面受体，PD-1有两个配体，分别是细胞程式死亡-配体1(PD-L1，又名B7-H1)和细胞程式死亡-配体1(PD-L2，又名B7-DC)。机体内的肿瘤微环境会诱导浸润的T细胞高表达PD-1分子，肿瘤细胞会高表达PD-1的配体PD-L1和PD-L2，导致肿瘤微环境中PD-1通路持续激活PD-L1与PD-1联接后，T细胞功能被抑制，不能向免疫系统发出攻击肿瘤的信号。PD-1抑制剂可以阻断PD-1与PD-L1的结合，阻断负向调控信号，使T细胞恢复活性，从而增强免疫应答。高特异性、低反应性的抗PD-1单抗已在多项临床试验中获得肯定，例如默沙东公司生产的名称为Keytruda(Pembrolizumab)的药物，以及施贵宝公司生产的名称为Opdivo(Nivolumab)nivolumab的药物。

但是，抗体药物应用存在很多问题，比如研发周期长，生产成本过高；难以大规模生产；稳定性差易降解，贮存成本高；容易被污染，维护成本费用高昂；并具有免疫原性等，限制了其在临床上的应用范围。

纳米抗体技术，是生物医学科学家在传统抗体的基础上，运用分子生物学技术结合纳米粒子科学的概念进行的抗体工程革命，从而研发出的最新和最小的抗体分子。1993年Hamers等报道，骆驼体内存在着天然缺失轻链和重链恒定区1(CH1)的重链抗体，克隆其可变区得到只由一个重链可变区组成的单域抗体，称为VHH(variable domain of heavychain of heavy-chain antibody)，现已被重新命名为“纳米抗体”(nanobody，Nb)。纳米抗体具有完整功能的最小的抗原结合片段，其晶体结构呈椭圆形，直径2.5nm，长4nm。Nb具有许多独特的性质，很适合进行基因改造，在疾病的精确诊断和靶向治疗等方面展现了广阔的应用前景。纳米抗体在化学组成和形状上比抗体简单许多，不具有化学疏水性，其抗热性和抗酸碱性更强，更容易相互结合或与其他化合物结合，能被单基因编码，容易用微生物合成。纳米抗体对环境具有良好的耐受性，具备高度的构象稳定性，而且分子质量更小，临床的治疗效果更好，同时这些小蛋白分子更容易合成，价格也更低。纳米抗体的独特的性质，使其在疾病的精确诊断和免疫靶向治疗等方面展现了更为广阔的应用前景。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，如何制备有效治疗肿瘤的药物。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了纳米抗体。

本发明的第一方面，提供了一种纳米抗体，称为PD-1/Nb52，该纳米抗体包含抗原决定簇互补区CDR和骨架区FR；所述纳米抗体的抗原决定簇互补区CDR由CDR1、CDR2和CDR3组成；所述CDR1的氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.8的第23-32位氨基酸；所述CDR2的氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.8的第49-56位氨基酸；所述CDR3的氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.8的第94-112位氨基酸。