[发明专利]携带海肾荧光素酶的鸭坦布苏病毒瞬时转染复制子及其构建方法和应用

说明书

本发明涉及一种携带海肾荧光素酶的鸭坦布苏病毒瞬时转染复制子及其构建方法和应用，所述复制子是在坦布苏病毒删除编码结构基因后在编码C蛋白N端前38个氨基酸的序列之后连入海肾荧光素酶报告基因，并在Rluc后插入编码口蹄疫病毒自剪接肽的序列FMDV2A，在坦布苏病毒的复制子5’UTR序列上游添加真核启动子CMV及原核启动子T7，在3’UTR下游添加丁型肝炎病毒核酶序列HDVr及SV40poly(A)序列，获得的复制子能够精确定量反映复制子在细胞内的复制情况，可方便的应用于研究坦布苏病毒乃至其他黄病毒的复制机理、抗病毒药物筛选、病毒与蛋白互作等。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及携带海肾荧光素酶的鸭坦布苏病毒瞬时转染复制子，还涉及瞬时转染复制子的构建方法和应用。

背景技术

我国是世界养禽大国，更是世界最大的养鸭国。鸭坦布苏病毒(Tembusu virus，TMUV)是一种能引起产蛋鸭采食量和产蛋率急剧下降，甚至停产直至死亡的一种新型黄病毒。鸭坦布苏病毒病自2010年首次爆发以来，给我国的养鸭产业造成了巨大的经济损失。几乎所有品种的鸭都能感染鸭坦布苏病毒，包括樱桃谷鸭、北京鸭、麻鸭等，其主要临床症状为：体温升高、食欲显著下降，四肢无力、瘫痪；产蛋大幅下降，排草绿色稀便，气味恶臭；雏鸭感染后以瘫痪、头颈震颤为特征。种鸭感染后，其特征性病变为卵泡膜出血，卵泡变形甚至破裂，所以该病曾被称为“出血性卵巢炎”，蛋鸭产蛋量大幅度下降甚至停止产蛋，严重者能够导致死亡，死亡率可以达到10％-30％。剖检时可以见到脾脏明显肿大，另外部分鸭肝脏出血严重，并同时伴有针尖状白色坏死点；卵巢病理变化非常严重，出血、萎缩、破裂，输卵管有大量粘液。此外，有报道鸡、鹅、麻雀等也能感染该病。

鸭坦布苏病毒是有囊膜的单股正链RNA病毒，其基因组约11kb，有I型帽子结构，无poly(A)尾巴，编码一条3425个氨基酸的多聚肽链。病毒基因组5’端和3’端分别有90～100bp、550～600bp非编码区，对病毒的复制起到重要作用。病毒基因组编码的多聚肽链在宿主细胞内酶和自身编码的非结构蛋白的作用下，裂解为10个单体蛋白，分别是衣壳蛋白C，膜蛋白前体蛋白prM，囊膜蛋白E，以及7个非结构蛋白NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5。

黄病毒复制子包含所有与病毒自我复制相关的元件，能够在宿主细胞体内自我复制，但不能编码结构蛋白，因此不会产生具有感染性的病毒粒子。基于DNA的复制子能够对黄病毒除删除掉的编码结构基因以外的任意位点进行突变，对于研究病毒的复制，非结构蛋白细胞内定位以及病毒包装有重要意义。复制子已经在其他黄病毒上得到了极大的应用，如黄热病毒(YFV)、登革病毒(DEGV)、日本乙型脑炎病毒(JEV)、昆病毒(KUN)、西尼罗病毒(WNV)，目前国内外尚无构建成功坦布苏病毒复制子的相关报道。因此，构建坦布苏病毒复制子对于研究坦布苏病毒甚至黄病毒其他病毒的复制、病毒的包装、抗病毒药物的筛选均有重大的意义及帮助，有助于理解坦布苏病毒的复制机理，更深入研究坦布苏病毒。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种携带海肾荧光素酶的鸭坦布苏病毒瞬时转染复制子，通过在黄病毒的复制子的基础上，人为插入一个能够编码荧光素酶的基因，使病毒非结构蛋白的表达情况能够通过检测荧光素酶活性或者检测荧光蛋白表达量来判断；通过构建的复制子质粒，可以实现在分子水平对黄病毒的改造，对于研究坦布苏病毒甚至黄病毒其他病毒的复制、病毒的包装、抗病毒药物的筛选均有重大的意义及帮助，有助于理解坦布苏病毒的复制机理，更深入研究坦布苏病毒。通过检测报告基因的活性能够方便且准确的定量检测TMUV复制子的复制情况。本发明的目的之二在于提供携带海肾荧光素酶的鸭坦布苏病毒瞬时转染复制子的制备方法；本发明的目的之三在于提供携带海肾荧光素酶的鸭坦布苏病毒瞬时转染复制子在定量检测鸭坦布苏病毒复制子的复制情况中的应用；本发明的目的之四在于提供携带海肾荧光素酶的鸭坦布苏病毒瞬时转染复制子在研究黄病毒的复制机理或抗病毒药物筛选中的应用。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：