[发明专利]用于检测感染毛蚶的牡蛎疱疹病毒的引物组和探针及其应用

说明书

本发明公开了一种用于检测感染毛蚶的牡蛎疱疹病毒的引物组和探针，所述的引物组由正向引物和反向引物组成，所述的正向引物的碱基序列如序列表SEQ ID NO.1中所示，所述的反向引物的碱基序列如序列表SEQ ID NO.2中所示；所述的探针的碱基序列如序列表SEQ ID NO.3中所示。本发明还公开了上述的引物组和探针在制备用于RPA检测感染毛蚶的牡蛎疱疹病毒试剂中的应用。该试剂检测病毒时耗时短、产率高，特异性高，且阴阳性结果差异显著，验证率高，更加明显可靠。

技术领域

本发明属于牡蛎疱疹病毒技术领域，具体涉及一种用于检测感染毛蚶的牡蛎疱疹病毒的引物组和探针及其应用。

背景技术

牡蛎疱疹病毒(Ostreid herpesvirus，OsHV)属于疱疹病毒属，是一种对贝类养殖业危害较为严重的病原。该病毒可感染并致死多种双壳贝类，包括牡蛎、扇贝、蛤仔以及魁蚶等。20世纪90年代以来，全球多个国家和地区养殖的长牡蛎(Crassostrea gigas)以及我国养殖栉孔扇贝(Chlamys farreri)等双壳贝类在夏季高温季节经常发生大规模死亡，给贝类养殖业带来了巨大的经济损失。目前，针对该病毒病尚无有效的治疗方法，病毒的早期准确检测对疾病的预防和控制尤为重要，因此建立一种简便、快速、灵敏、准确的病毒检测方法对病毒病的防控具有重要意义。目前，常用的是以聚合酶链式反应(PCR)为代表的病原检测技术。但是PCR反应对精准控温仪器的要求较高、耗时较长、灵敏度较低，在应用上有一定局限性。

重组酶聚合酶扩增(RPA)是近几年出现的一种可在室温下进行的核酸快速检测技术，无需温控设备，特异性高，具有比PCR还要好的灵敏度，可在15分钟内完成反应，很好的弥补了PCR检测方法的局限。

在前期研究工作中，本申请发明人首次在养殖毛蚶(Scapharca subcrenata)体内发现携带率很高的OsHV病原。毛蚶体内的病毒基因组DNA与牡蛎、扇贝等其它种类的基因组DNA具有一定相似性，但也有明显的不同，国内外还没有专门针对毛蚶OsHV的核酸扩增检测方法。RPA检测所用的引物组和探针是其核心组分，它们决定着RPA的检测效果。但RPA引物和探针的成本高，设计难度较大，没有类似PCR引物的专业设计软件，也没有指南可以参考，检测的灵敏度和特异性完全依赖于引物设计者的经验和大量的试验验证。有时从数十套候选引物探针组合中都无法筛选到1套可用的检测序列，因此引物设计是开发本发明的另一关键。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于检测感染毛蚶的牡蛎疱疹病毒的引物组和探针。

本发明的目的还在于提供上述的引物组和探针在制备用于RPA检测感染毛蚶的牡蛎疱疹病毒试剂中的应用。

本发明的第一个目的是通过如下技术方案实现的：一种用于检测感染毛蚶的牡蛎疱疹病毒的引物组和探针，所述的引物组由正向引物和反向引物组成，所述的正向引物的碱基序列如序列表SEQ ID NO.1中所示，所述的反向引物的碱基序列如序列表SEQ ID NO.2中所示；所述的探针的碱基序列如序列表SEQ ID NO.3中所示。

本发明的引物组和探针序列是根据牡蛎疱疹病毒ORF 95(GenBank accessionno.AY509253.2)核酸序列设计而得。

具体的，该引物组由正向引物FP和反向引物RP组成，其序列如下：

正向引物FP：catgtttacg tggaaatgtt ggattggcta

反向引物RP：atgtcaaata ggttgttggc agtgatggtc。

探针的碱基序列为：

tacagcatcgcccgatgcacttcgtgat(dT-FAM)ca(THF)tt(dT-BHQ1)atcggctcaatatata(C3spacer)。