[发明专利]含抑铁素重组减毒沙门杆菌及构建方法、表达或递送载体

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种含抑铁素重组减毒沙门杆菌及构建方法、表达或递送载体。

背景技术

结核病是严重威胁人类健康的疾病，感染者约占全球总人口的三分之一。据WHO最新全球结核病控制报告的数据表明，2016年约有900万新发病例，150万人死亡，死亡人数居单一传染病之首，而我国的结核病患者人数居全球第二位。目前结核病防治工作中存在几大难题：①大量潜伏感染者：结核分枝杆菌(Mtb)为细胞内寄生菌，感染主要寄生于巨噬细胞(MΦ)内，并通过其逃逸机制逃避免疫杀伤，在MΦ内长期存活而造成持留(persist)。为杀灭少量的持留菌需维持化疗5个月以上，易造成结核病治疗后的复发，同时也是耐药菌产生的重要原因之一。②多耐菌株(MDR)的流行：据WHO最新全球结核病控制报告2016年有48万耐药结核的新发病例，只有13.6万检测出携有MDR株。耐多药结核病的病程短，死亡率高，控制和治疗困难。③免疫低下人群的合并感染：各种原因(如HIV感染、衰老、肿瘤)所致的免疫低下人群合并感染结核病的情况增多，特别是HIV的感染是最具危险的因素。卡介苗(BCG)是目前预防结核病最有效的疫苗，其保护效果约为80％-0％，因地区、人群不同而异。目前结核病发病率的上升趋势已使人们质疑BCG的效果，寻求新型结核病防治手段已成当务之急。MΦ是Mtb寄生和潜伏的场所，也是抗Mtb感染的主要效应细胞。首先，MΦ是Mtb感染的第一道防线，通过吞噬作用杀灭Mtb，参与固有免疫。其次，作为抗原提呈细胞将Mtb有效抗原成分提呈给T细胞，启动适应性免疫。最后在免疫效应阶段，受多种细胞因子活化，作为主要效应细胞参与对Mtb的杀灭。因此，MΦ是抗Mtb感染中最重要的细胞。但同时MΦ是Mtb寄生和潜伏的场所，为Mtb繁殖提供所需的生长环境。铁是Mtb必不可少的营养元素，Mtb能分泌转铁体到吞噬体外摄取铁，以维持其生存。目前针对结核病的重组减毒沙门杆菌是将重要的保护性抗原如Ag85B，Ag85A，以及ESAT-6、CFP-10等的编码基因引入减毒沙门杆菌，这些对策都是围绕Mtb暴露前的预防性疫苗，而暴露后的治疗性疫苗研究则是未来的发展趋势。

综上所述，现有技术存在的问题是：目前结核病防治方法存在大量潜伏感染者，多耐菌株(MDR)的流行，免疫低下人群的合并感染；潜伏感染者，在没有发病的时候，结核杆菌是潜伏在人体内的巨噬细胞内的，此时用现在的抗结核药物是没有效果的。耐菌株(MDR)的流行，用目前的抗生素也是效果不好的。潜伏感染需要靶向递送抗结核的药物到巨噬细胞内，而沙门菌可以靶向递送抑铁素到巨噬细胞内，杀灭潜伏的结核杆菌和多耐药的菌株目前的疫苗主要是预防性疫苗对潜伏感染者无效，而本发明是治疗性疫苗，可以有效治疗大量潜伏感染者。同时，目前多耐菌株(MDR)的流行，需要新的药物靶点，而本发明中的抑铁素是一种新的抗结核的蛋白，还没有耐药的发生，可以有效的抗结核。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种含抑铁素重组减毒沙门杆菌及构建方法、表达或递送载体。

本发明是这样实现的，一种含抑铁素的质粒，所述含抑铁素的质粒为pBudCE4.1-Sid。

本发明的另一目的在于提供一种所述含抑铁素的质粒的构建方法，所述含抑铁素的质粒的构建方法包括：取鼠粒细胞抽提细胞总RNA，逆转录后用高保真酶、引物进行PCR扩增，获得抑铁素基因目标序列，并克隆入pBudCE4.1质粒中构建pBudCE4.1-Sid。

本发明的另一目的在于提供一种由所述含抑铁素的质粒构建的含抑铁素重组减毒沙门杆菌。

进一步，所述含抑铁素重组减毒沙门杆菌的构建方法包括：

步骤一，用LB培养基培养沙门杆菌，制备感受态细菌；

步骤二，将质粒电转化SL7207，在含Zeocin抗性的培养基中获取阳性克隆，制备相应的rSL7207；

步骤三，用rSL7207感染RAW264.7细胞，分别检测抑铁素在MΦ中的表达。

本发明的另一目的在于提供一种由所述含抑铁素重组减毒沙门杆菌制备的表达载体。

本发明的另一目的在于提供一种由所述含抑铁素重组减毒沙门杆菌制备的递送载体。