[发明专利]一种PEG修饰蛋白多关键参数同时检测方法

权利要求书

1.一种PEG修饰蛋白多关键参数同时高效液相检测方法，同时检测PEG修饰蛋白的纯度、蛋白浓度、PEG结合数和游离PEG，所述方法采用紫外检测和示差检测联用。

2.权利要求1所述的PEG修饰蛋白多关键参数检测方法，其特征在于包含以下步骤：

首先，分别对PEG修饰蛋白的原蛋白及其所用PEG的标准品进行紫外和/或示差检测，并建立标准曲线：

将蛋白浓度已经标定确定的原蛋白标准品稀释，根据其浓度C_原蛋白与相对应的紫外吸收值峰面积UV_原蛋白进行线性拟合，建立标准曲线①：UV_原蛋白-C_原蛋白

将蛋白浓度已经标定确定的原蛋白标准品稀释，根据其浓度C_原蛋白与相对应的示差吸收值峰面积RI_原蛋白进行线性拟合，建立标准曲线②：RI_原蛋白-C_原蛋白；

将PEG标准品溶液稀释，根据其浓度C_PEG与相对应的示差吸收值峰面积RI_PEG进行线性拟合，建立标准曲线③：RI_PEG-C_PEG；

其次，对供试品同时以紫外、示差检测器检测，并计算得到以下参数：

1)纯度测算：体积排阻色谱柱根据表观分子量大小对供试品的纯度进行分析，采集紫外检测器下的出峰，积分计算纯度；

2)蛋白浓度测算：将供试品溶液在紫外检测器下的峰面积UV_修饰蛋白代入标准曲线①，计算得到供试品中的蛋白浓度C_原蛋白；

3)游离PEG测算：将供试品溶液在示差检测器下游离PEG的峰面积RI_游离PEG代入标准曲线③，计算得到供试品中游离PEG浓度C_游离PEG；

4)PEG结合数测算：将上述2)中计算得到含量C_原蛋白代入标准曲线②，计算得原蛋白的示差吸收值峰面积RI_原蛋白；RI_PEG＝RI_修饰蛋白-RI_原蛋白，代入标准曲线③计算得到修饰蛋白中PEG所占有的含量C_PEG，

其中，C_原蛋白和C_PEG分别为修饰蛋白中原蛋白部分和PEG部分的质量浓度，M_原蛋白和M_PEG分别为原蛋白部分和PEG部分的分子量。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，采用体积排阻色谱或者反相色谱进行分离检测。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，采用体积排阻色谱法中流动相含5％(V/V)异丙醇的20mM磷酸盐缓冲液，pH6.5。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，采用体积排阻色谱法中流动相流速为0.6ml/min。

6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，采用体积排阻色谱法中色谱柱柱温35℃。

7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，采用体积排阻色谱法中紫外检测器波长为280nm。

8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其特征在于，PEG修饰蛋白是聚乙二醇随机或定点修饰的门冬酰胺酶、激肽原酶。