[发明专利]一种过表达产甘油假丝酵母CgGAD1提高渗透压耐受性的方法

说明书

本发明涉及一种来源于产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)的耐高渗功能基因CgGAD1的克隆及其应用，属于分子生物学、生物技术领域。方法是，从产甘油假丝酵母C.glycerinogenes的染色体基因组DNA中扩增得到γ‑氨基丁酸合成关键酶基因CgGAD1，该基因全长1830bp，无内含子。该基因是耐高渗功能基因，过量表达CgGAD1可增加γ‑氨基丁酸在胞内的积累，提高菌株在高渗条件下的生长。本发明提供了一种利用基因工程手段进一步提高C.glycerinogenes对渗透压耐受性的方法，为其它微生物及高等真核生物的抗逆性改良提供了优良的基因材料及研究思路。

技术领域

本发明涉及一种产甘油假丝酵母CgGAD1基因的克隆、过表达及耐高渗透压抗盐性功能分析和应用，属于分子生物学和生物技术领域。

背景技术

产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)是我国拥有自主知识产权的一株具有优良发酵性能的酵母菌株，长期被应用于甘油的工业化生产。Candida glycerinogenes具有高产量、高转化率、生产强度大的特点。与S.cerevisiae等常规的模式酵母相比，Candida glycerinogenes具有更高的渗透压耐受性，能够在超过550g/L葡萄糖的培养基中进行正常的生理代谢，因此在浓醪发酵等领域中具有潜在的应用前景。

酵母在生长或增殖过程中，尤其是在工业发酵环境下通常都会遭遇各种外部的环境压力。尤其是外部的高渗透压往往会导致细胞内部水分流失，造成细胞膨胀压的损失，从而引起细胞萎缩，这对酵母生理功能的发挥是极为不利的。为了应对复杂的外部环境压力，酵母细胞在长期进化过程中逐步形成了一系列特定的适应性机制，使其能够准确感受周围环境的变化并通过不同的调节机制迅速做出响应，以此来保护细胞。在S.cerevisiae中，细胞主要通过利用Hog1介导的胞内甘油快速积累机制来提供渗透压保护。除此之外还存在多种调节机制，如离子的体内稳态(依赖于ATP驱动的Na+、K+主动转运和H+反向转运)，TOR(Targetofrapamycin，雷帕霉素靶标信号途径)和CWI(Cellwallintegrity，细胞壁完整性途径)等。S.cerevisiae还通过积累阳离子，糖(如海藻糖，蔗糖，糖原)，多元醇(如甘露醇，山梨醇等)及氨基酸(如脯氨酸，精氨酸和谷氨酸)等相容性物质来恢复细胞的膨胀压。这类物质既可能来源于内部合成，也可能吸收自外界环境，它们是酵母的渗透压响应调控机制的重要组成。在高渗透压条件下，Candida glycerinogenes的γ-氨基丁酸透性酶基因受到强烈的诱导，其胞内含量得到一定程度的积累，在培养基中外源添加γ-氨基丁酸可促进Candida glycerinogenes在渗透压条件下的生长，表明Candida glycerinogenes可利用γ-氨基丁酸作为渗透压保护剂。

发明内容

本发明的目的是提供一种来源于产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)的γ-氨基丁酸合成关键酶谷氨酸脱羧酶基因CgGAD1，该基因核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。

本发明的另一目的是提供一种提高产甘油假丝酵母在高渗条件下菌体生长的方法。通过过量表达来源于自身的CgGAD1，增加γ-氨基丁酸在胞内的积累，促进菌株在高渗条件下的菌体生长。

本发明的技术方案：一种提高产甘油假丝酵母抵御外界高渗透压的方法，利用尿嘧啶营养缺陷型的甘油工业生产菌株产甘油假丝酵母Candida glycerinogenesU5为研究对象，克隆获得来源于产甘油假丝酵母的谷氨酸脱羧酶基因CgGAD1，将其以整合表达的方法过表达于Candida glycerinogenesU5中，重组菌的胞内γ-氨基丁酸含量得到明显的升高，其在高渗透压条件下的菌体生长也发生显著提高，表明通过过量表达谷氨酸脱羧酶基因可有效保护产甘油假丝酵母抵御外界渗透压胁迫。